利用CRISPR/Cas9诱导的DNA瘢痕序列追踪细胞谱系

2018-04-17 绿谷生物 Nat Biotechnol
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 如今,诸如RNA测序之类的技术正在揭示出哪些基因在每个细胞中表达。随后,科学家们就能够利用类似的表达谱对所有的细胞进行系统性地分类。德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心数量发育生物学研究小组负责人Jan Philipp Junker博士说,“当我们使用这种技术研究器官或有机体时,我们不仅发现熟悉的细胞类型,我们也会发现未知的和罕见的细胞类型。下一个问题很明显---这些不同的细胞类型来自于何处?”针对于这一点,在一项新的研究中,Junker团队开发出一种被称作LINNAEUS(lineage tracing by nuclease-activated editing of ubiquitous sequence, 通过对普遍存在的序列进行核酸酶激活的编辑来开展谱系追踪)的技术,它能够让人们确定细胞类型和每个细胞的谱系。相关研究结果于2018年4月9日在线发表在Nature Biotechnology期刊上,论文标题为“Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR–Cas9-induced genetic scars”。

图片来自Junker Lab, MDC。
 

Junker说,“我们想要理解有机体发育的灵活性。”如果在胚胎发育期间发生损伤(比如,由突变或环境影响导致的损伤),那么修复机制就应确保动物在以后看起来显得健康。仅每个细胞的谱系才能够揭示损伤程度和修复机制的真实情形。即便是成年斑马鱼的心脏在遭受损伤后也能够再生。Junker说,“这是生物学发育过程在自我重复,还是有新的事物出现?细胞是否会发生改变并承担其他任务?”在某些情况下,一种细胞类型的缺失可导致特定疾病。在未来,科学家们将能够使用LINNAEUS可追踪的所有细胞谱系树,并针对这些问题提出新的假说。

快速修复会导致瘢痕序列产生

这种技术基于DNA中的瘢痕序列(scar sequence),这些瘢痕序列当汇总在一起时就像条形码一样发挥作用,能够确定每个细胞的谱系。虽然斑马鱼胚胎仍处于单细胞阶段,但是Junker团队给这些胚胎注入CRISPR-Cas9系统。在接下来的8个小时内,Cas9重复性地切割斑马鱼从不需要的基因序列:编码红色荧光蛋白(RFP)的基因。这些斑马鱼胚胎产生的红色荧光逐渐消失,而且数千个瘢痕序列在DNA损伤区域中形成。Junker说,“CRISPR总是在确切的位点上进行切割。但是,在下一次细胞分裂发生之前,这些细胞的修复时间不超过15分钟。这种修复工作必须快速完成,这样染色体片段就会连接在一起。这也是错误发生的地方。DNA中的瘢痕序列具有随机的长度,而且它们的确切位置也会发生变化。”子细胞在细胞分裂过程中遗传这些瘢痕序列。因此,源自相同祖先的细胞能够通过它们的遗传性瘢痕序列来加以鉴定。

尽管单细胞RNA测序可依据细胞类型绘制数千个细胞的图谱,但是这些瘢痕序列表明这些细胞之间存在着数百万个连接。利用这些数据重建细胞谱系树面临着各种各样的挑战。有些瘢痕序列是特别可能会发生的。Junker说,“这是危险的,这是因为如果相同的瘢痕序列都在心脏细胞和脑细胞中产生,那么人们就可能会错误地认为它们具有相同的祖先。因此我们必须知道哪些瘢痕序列是不值得我们信任的,并将它们滤除掉。”此外,论文共同第一作者、马克斯-德尔布吕克分子医学中心生物信息学家Bastiaan Spanjaard说,并非细胞中的所有瘢痕序列都是能够找到的。“因此,我们开发出一种方法来弥合能够让我们构建出细胞谱系树所需的数据上的差距。”

聚焦数据集

最终的结果是构建出具有彩色饼图的细胞谱系树,并在饼图上进行分支划分。每个划分都是依据瘢痕序列,饼图上的每种颜色指出这个划分是在哪个细胞类型中发生的。研究人员能够根据他们想要的细节聚焦这个非常大型数据集的紧凑表示。

Junker说,“比如,在心脏中,有两种细胞类型是几乎没有区别的。但是这些细胞谱系树表明它们的发育很早就在不同的方向上发生分叉。我们接下来想要观察这些细胞类型存在于斑马鱼心脏中的何处。这通常为它们发挥何种功能提供首个指示。”他的实验室正在继续使用斑马鱼作为模式生物开展研究,但是Junker也认为将该技术应用于人体类器官中具有巨大的潜力。这最终能够帮助人们理解患者中的哪些突变会导致细胞谱系树遭受永久性损伤。

参考资料:

Bastiaan Spanjaard, Bo Hu, Nina Mitic et al. . Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR–Cas9-induced genetic scars. Nature Biotechnology, Published Online:9 Apr 2018 doi:10.1038/nbt.4124