构建出增加基因组靶向范围的CRISPR/Cas9系统

2018-09-24 绿谷生物 Science
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基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

在CRISPR/Cas9系统中,酶Cas9在DNA靶位点上进行切割,其中这种靶位点是这样确定的:一种被称作CRISPR RNA(crRNA)的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracrRNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起,形成嵌合RNA(tracrRNA/crRNA),然后,借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对,以这种方式,这种嵌合RNA就能够引导Cas9结合到这个靶位点上并进行切割。在实际应用时,人们可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA(gRNA)或者融合在一起形成单向导RNA(single guide RNA, sgRNA),并被用来引导酶Cas9结合到靶DNA序列上并进行切割,其中Cas9与sgRNA一起被称作Cas9-sgRNA系统。

此外,CRISPR/Cas9系统靶向识别和切割与前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)相邻的特定DNA位点。作为一种最为频繁用于基因组编辑的Cas9酶,来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(SpCas9)仅识别作为PAM的NGG序列(简称NGG PAM,其中N代表任何一种碱基),这就限制了基因组中能够被靶向的区域。

图片来自Frontiers in Genetics, 24 September 2015, doi:10.3389/fgene.2015.00300。
 

在一项新的研究中,为了解决这个限制,来自日本东京大学、庆应义塾大学、大阪大学和美国布罗德研究所、麦戈文脑研究所和麻省理工学院的研究人员构建出一种合理设计的SpCas9变异体(SpCas9-NG),它能够识别NG而不是NGG。这种SpCas9-NG变异体增加了基因组中的靶向范围,但是具有与野生型SpCas9类似的特异性。晶体结构揭示出与第三个碱基之间的碱基特异性相互作用的丧失得到新引人的非碱基特异性相互作用的补偿,从而能够识别作为PAM 的NG序列(NG PAM)。

这些研究人员进一步证实在人细胞中,这种SpCas9-NG变异体在携带着NG PAM的内源性靶位点中诱导碱基插入或删除(insertion or deletion, indel)。

最后,这些研究人员还发现将这种SpCas9-NG变异体与活化诱导的胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase, AID)融合在一起能够调节人细胞中携带着NG PAM的靶位点上的C→T转化,即由碱基胞嘧啶(C)转化为碱基胸腺嘧啶(T)。

综上所述,SpCas9-NG是CRISPR/Cas9基因组工程工具箱的有力补充,可用于从基础研究到临床治疗的一系列应用中。

参考资料:

Hiroshi Nishimasu, Xi Shi, Soh Ishiguro et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science, 21 Sep 2018, 361(6408):1259-1262, doi:10.1126/science.aas9129.