胚胎干细胞（ES）

1．什么是胚胎干细胞？ 　

胚胎干细胞是在人胚胎发育早期——囊胚（受精后约5—7天）中未分化的细胞。囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。如外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。

2．胚胎干细胞研究的意义：

早在1970年Martin Evans首次从小鼠胚囊中分离出小鼠胚胎干细胞，小鼠胚胎干细胞就可以成功地在体外进行培养。人的胚胎干细胞的体外培养在1998年由美国科学家培养成功。

研究证实：分离的小鼠胚胎干细胞在体外可以分化成各种细胞，包括神经细胞，造血干细胞（血细胞的前体）和心肌细胞。令人惊奇的是，这些细胞还具有自发发育成某些原始结构的趋势。如在一定的培养条件下，一部分胚胎干细胞会分化为胚状体（与小的跳动的心脏具有奇异的相似之处），而另一些细胞会发育成包含造血干细胞的卵黄囊。形成胚状体和卵黄囊的比例可通过改变培养基而改变，但至今还没有诱导胚胎干细胞发育为一纯的分化细胞群的报道。从理论上讲，小鼠胚胎干细胞具有发育成某一器官的能力，但还没有用干细胞体外培养成器官的报道。不过，如果将小鼠胚胎干细胞移植到重度复合免疫缺损小鼠（SCID，它不会排斥移植的细胞）体内时，胚胎干细胞则能够发育成肌肉、软骨、骨骼、牙齿和毛发。但无论如何，如果直接将分离的小鼠胚胎干细胞植入子宫内，它们不会发育成个体小鼠，因为没有着床必需的滋养层细胞。这种条件下，胚胎干细胞被认为是多能的（pluripotent），而不是全能的（totipotent）。尽管如此，如果将胚胎干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将该胚胎植入小鼠子宫中，那么可以获得完全是由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠。这表明了胚胎干细胞具有难以置信的全能性。

由于以下几个原因，胚胎干细胞的研究使人感到激动。首先是它们拥有类似胚胎的全能分化性，可以从单个的受精卵发育成完整的个体，能够给我们解释完整的发育体系，而成体个体来源的多能干细胞就不可能。同时，极早期的胚胎发育均可追溯到ES细胞，而不可能是成熟个体来源的多能干细胞。ES细胞也是唯一不死的细胞，能够非限定地分化，是细胞的源头。ES细胞天生就是全能的，这就是问题的关键，换言之，他们能制造机体需要的全部细胞。最后，ES细胞是遗传操作的最早期细胞。因此，尽管目前的争论集中在治疗方面，但也许ES细胞最伟大的用途是作为科学研究的工具。

人胚胎干细胞的分离及体外培养的成功，将给人类带来医学革命。如果科学家最终能够成功诱导和调控体外培养的胚胎干细胞正常的分化，这一技术将对基础研究和临床应用产生巨大的影响，有可能在以下领域发挥作用：体外研究人胚胎的发生发育，非正常发育（通过改变细胞系的靶基因），新人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。

　　人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的极早期事件的良好材料和方法，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术，比较胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。另一个令人兴奋的应用在于新药的发现及筛选。胚胎干细胞提供了新药的药理、药效、毒理及药代等研究的细胞水平的研究手段，大大减少了药物实验所需动物的数量。目前上述实验使用的细胞系或来自其他种属的细胞系，很多时候并不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发生机制和发展过程，以便找到有效和持久的治疗方法。

国家自然科学基金项目――《药物介导胚胎干细胞体外定向分化的干预效应研究》近日在杭州取得重大突破。科学家们通过通过生物因子的作用和药物的诱导，目前已成功地将胚胎干细胞体外定向分化成搏动的心肌细胞，并在此基础上首次利用胚胎干细胞成功地构建了新药筛选模型。到目前为止，他们已在实验室中先后两次成功地培养出了总共30个自主跳动的单一心肌细胞团，分化成功率已高达80％。实验室观察表明，这些细胞团均具有正常心肌细胞的自律性、应激性和兴奋性。据介绍，在成功分化出心肌细胞的基础上，课题组将于近期开始定向分化单一的神经细胞和胰岛细胞的工作。 这一成果的重大意义在于：单一细胞的形成过程重现了胚胎细胞发育过程的全部生物信息，反映人类疾病的发生机制和发展过程，并提供了药物作用的重要靶点，从而在世界上首次利用胚胎干细胞成功地创建了一个新药的筛选模型。该筛选模型可在基因层面上对新药的疗效、作用机理和安全性进行快速安全的鉴定，并对于发现和研制治疗新药具有积极意义。

美国麻省理工学院的科学家2002-03-26日宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，进一步证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 在研究中，兰格等首先使这些干细胞发育至能分化成不同细胞类型的阶段，然后从中提取出有可能分化成内皮细胞的干细胞，进一步对其进行培养。当这些细胞形成原始的血管结构时，研究人员将其移植入经过处理后不会产生排异反应的实验鼠体内，并发现它们在１４天后形成了毛细血管网。他们的研究还显示，其中一些毛细血管中含有鼠的血细胞，显示这些血管已经自发地与鼠循环系统相结合。

3．胚胎干细胞的标志及建系：

长期以来，科学家一直在寻找确定干细胞的精确方法。干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统为例，干细胞的表面标志有Sca-1和c-kit等。另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物，如人造血干细胞表现为CD34+和Thylo而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性[8]。这些特异的标记物可能与其分化调控有关，如上皮干细胞有β1整合素的高表达，而β1整合素可介导干细胞与细胞外基质粘附从而抑制其分化的发生。另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即可分离纯化干细胞。但大多数用这种方法确定的细胞都不是真正的干细胞。

人们不断寻找各种各样的标记，但没有人找到绝对特异的干细胞标记。St.Jude 儿童研究医院实验血液学部主任Brian Sorrentino博士领导的研究人员找到了他们认为是世界上第一个“通用的”干细胞标记--ABCG2/Bcrp1。这个基因在不同来源的干细胞中都有表达，而在大多数成熟细胞中不表达，它将成为干细胞标记。 这项发现公布在9月出版的《自然医学》上，暗示新发现的ABCG2/Bcrp1基因将为科学家提供确定真正干细胞的更精确方法。研究人员发现在骨髓、骨骼肌以及早期小鼠胚胎干细胞中ABCG2/Bcrp1基因都以一种高度特异性形式表达。

目前，人类多能性干细胞系的建立有两个来源，其方法与以往在动物模型中建立的方法相同。

（1） 从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞。 Dr. Thomson从IVF（体外受精）临床实验室得到胚胎，这些胚胎是不育症临床治疗不需要的，用于繁殖，而非研究目的。从捐献者夫妇处获得知情同意书后，Dr.Thomson分离了内细胞群（图III），将这些细胞进行培养，产生一个多能性干细胞系。

（2）从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能性干细胞。捐献者自行决定了终止妊娠，从他们那儿获得了知情同意书后，Dr. Gearheart从原本要发育成睾丸或卵巢的胎儿部位取得细胞。尽管Dr. Thomson 实验室和Dr. Gearheart实验室使用的细胞系来源不同，但发育成熟的细胞看起来非常相似。

体细胞核转移（SCNT）是得到多能性干细胞的另一种途径。在SCNT的动物研究中，研究者将一个正常的动物卵细胞去除细胞核（含染色体的细胞结构）。存留在卵细胞内的物质含营养成分和对胚胎发育非常重要的能量物质。而后，在非常精细调控的实验室条件下，将单个体细胞——除卵细胞或精子细胞之外的任一种细胞——与除去核卵细胞放在一起，使两者相融合。融合细胞以及其子细胞具有发育成一个完整个体的潜能，因此是全能性的。正如图I所示，这些全能性细胞不久将形成胚囊，从理论上来说，可利用胚囊的内细胞群来建立多能性干细胞系。实际上，任何一种可生成人类胚囊细胞的方法都有可能成为人体多能性干细胞的来源。

建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系更为实用和可行的方案有三个：（1）应用克隆技术，用人成熟细胞核置换人卵细胞的遗传物质，然后在体外将其培养至胚泡期，分离胚胎干细胞，用于研究和治疗。此时胚胎尚未开始分化，各系统也未开始发育，故不能称之为“人”，因此这一技术与“克隆人”有明显区别。这一策略具有很大的诱惑力，如将正常细胞核置入受体无核卵细胞中，培养和分离胚胎干细胞，在将其体外定向诱导分化为各种特定的功能细胞，用于治疗因这些细胞损伤而引起的多种严重疾病。例如分化为多巴胺神经元治疗帕金森病，分化为胰岛细胞治疗糖尿病，分化为肝细胞和肌细胞治疗肝纤维化和肌萎缩，甚至还可以分化为CD4+细胞治疗艾滋病。目前利用核移植技术获取胚胎干细胞已在羊和小鼠实验中得到验证，但距其应用于人类疾病的治疗还需较长时间。（2）将人类的细胞核置入到其它哺乳动物的无核卵细胞以获取胚胎干细胞。通过对牛、羊、鼠的研究已经证实，克隆的后代看起来都与提供起源细胞核的供核动物的后代相象，而不象供卵者的后代。因此，这一策略可以用来获取胚胎干细胞，并已开始在牛和鼠身上进行实验，如果可行，那么便可以避免应用人的卵细胞。目前异种核移植尚未得到令人鼓舞的结果。此外在伦理学上，这种通过其它动物的卵细胞获得的胚胎能否被称为人的胚胎也将成为一个新的课题。（3）将成人的细胞核植入胚胎干细胞的胞浆内，通过胚胎干细胞的胞浆与供体细胞核的作用，诱导表达胚胎干细胞特异性的基因已有研究发现，将成纤维细胞核植入肝细胞的胞浆中，结果可以表达一个肝细胞特异性的基因。但这一技术目前还不成熟。

胚胎干细胞最激动人心的潜在应用是用来修复甚至替换丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化为所有类型组织细胞的能力。任何涉及丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森氏综合症、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默氏病等），美国威斯康星大学的研究人员于2001年9月首次将人类胚胎干细胞转化为血细胞，向为医学治疗创造血液供应迈出了重要关键的一步。 用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复坏死的心肌等。尤其是对于后两项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，因为目前认为成年人的心脏和胰岛几乎没有干细胞，因而仅靠自身无法得到修复。为了基因治疗和防止免疫排斥效应，还可以对胚胎干细胞的基因做某些修改。干细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，因为它可以自我复制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不必担心象分化的细胞那样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因缺陷病如囊性纤维化——一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中，经过九月怀胎将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免疫排斥效应发生的目的。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发育成的组织和器官是否有生理缺陷如免疫能力降低还不得而知。

另一种克服移植免疫排斥的途径就是前面描述的结合克隆技术创建病人特异性的胚胎干细胞。用这种胚胎干细胞培养获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体细胞的病人完全一致，不会导致任何免疫排斥反应。如果这一设想能够变为现实，将是人类医学中一项划时代的成就，它将使器官培养工业化，解决供体器官来源不足的问题；器官供应专一化，提供病人特异性器官。人体中的任何器官和组织一旦出现故障，将像更换损坏的汽车零 件一样可随意更换和修理。