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寡核苷酸纯化方法

  

 寡核苷酸,是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称,很容易和它们的互补对连接,常用来作为探针确定DNA或RNA的结构,经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。然而设计正确的寡核苷酸序列可能是有些困难的,必须要有恰当的长度,合适的C-G,T-A含量,不能形成二级结构,必须有合适的纯化方法等。寡核苷酸的合成通常会导致不可避免的杂质积累,这些杂质是失败的序列:较短的序列,较长的序列,修改的序列或者是合成过程留下的杂质。这些杂质可能会影响你的实验,因为它们会与全长产品竞争,或者抑制反应,因此进行纯化是很有必要的。如下介绍几种纯化的方法。

 

进行寡核苷酸纯化有许多不同的方法,这主要依赖于纯化的数量,纯化的程度以及对技术的要求。当然,你想要你的寡核苷酸尽可能地纯净,但我们知道有一些技术可以处理一些杂质,而不影响我们的实验结果,我们要确切知道寡核苷酸在你的实验中的作用,再进行方法的选择。

 

Oligonucleotide-purification

 

1.脱盐作用

 

脱盐是一个非常基本的纯化过程,使用正相色谱法将多余的盐从混合物中去除,产生无盐的,随时可以使用的DNA溶液,对一些实验比如PCR,扩增限制片段多态性(ARFP)分析,微阵列等可以满足要求。但是脱盐作用不能移除失败的序列。

 

为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构,首先必须去除保护基团,通过浓氨水处理,合成的寡核苷酸从固相载体上分离,苯甲酰基和异丁基等保护基团被去除,必要的去保护步骤完成后,寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物,所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。

 

2.OPC柱

 

OPC柱中装有对DMT具有亲和力的树脂,合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT,所有合成产物吸附在OPC柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有DMT的片段吸附能力强,不易被洗脱,不带有DMT的片段吸附能力弱,被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去DMT基团,再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。此方法快速,简易。但是其专一性吸附DMT能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小,特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。

 

3.PAGE纯化

 

PAGE纯化是根据大小和构象来区分目的序列和失败序列,利用长短片段带的电荷不同,电泳迁移率不同来进行分离。通常用于x射线结晶学、基因合成和诱变研究。可以与脱盐法综合使用。

优点:适用于长的寡核苷酸的纯化(50-100mer)

获得的寡核苷酸纯度较高,超过95%

缺点:实验步骤多,费人工。

一次只有很少量的寡核苷酸被纯化,产量非常小

在PAGE之后需要提取和脱盐,将导致纯化产率的下降。

 

4.HPLC纯化

 

适用于对寡核苷酸纯度要求较高,比如定向诱变,定量的基因探测,诊断学。阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率,对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率,纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度。

优点:自动化程度高、快速、简便,纯度高

缺点:需要仪器,对大于35-mer的长片段纯化效果不理想。

寡核苷酸 纯化方法
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