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免疫组化结果判断的基本原则

  

 免疫组织化学(简称免疫组化)是组织化学的一种,它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点,通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂,如酶、金属离子、同位素等,显示一定的颜色,并借助显微镜观察其颜色的变化,从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。免疫组化标记具有形态学特点,若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断,现择要分述如下:

Immunohistochemistry

 

一、阳性标记色度特征

 

免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。一般而言,抗原含量越多,分布密度越高,标记方法越敏感,阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为:淡黄色,提示为弱阳性;棕黄色,为中等度阳性;棕黑色,示为强阳性。在结果判断中,后两者较有意义,可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方法学因素外,可能与细胞只有轻度异常表达,或某些细胞摄取了周围组织抗原之故。

 

二、阳性标记细胞学特征

 

免疫组化标记中,阳性标记细胞学特征是反映抗原在细胞中的定位和分布情况。在诊断中阳性细胞以拟标记的细胞为前提,阳性表达必须在细胞特定的抗原部位,若不在抗原所在部位的阳性表达和非目标细胞即使阳性也不应作为判断依据。根据抗原在细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位可分为以下5种类型:

1.胞膜型  阳性颗粒主要分布于细胞膜表面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞。此类型常见于某些膜抗原,如上皮膜抗原(EMA)、白细胞共同抗原(LCA)及B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原(GAA)和Ki-1等。

2.胞核型  阳性颗粒定位于细胞核,呈均匀分布或位于核膜下,有的呈小斑块状不规则分布。此多见于增殖细胞核抗原、Ki-67及激素受体中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和基因p53等。

3.胞浆型  阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗原均属于此种类型,如细胞角蛋白、波形蛋白、结蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特异性抗原(PSA)等。依据抗原在胞浆内分布形式,通常表现为弥漫性分布或局限性分布。前者阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆。局限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中的某一部位、核周或细胞浆的一侧。

4.微绒毛型  抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛,而胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表达。这种表现形式最常见于各种腺癌,如甲状腺癌、乳腺癌、胃肠腺癌、胆道腺癌、等。其特点是阳性颗粒除靠近腔面阳性外,其余基底部可呈阴性反应。

5.复合型  在常规免疫组化标记中,同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆,但很少发现胞膜和胞核同时表达。值得注意的是组织标本固定不及时造成抗原移位使胞核和胞浆同时阳性。

 

三、非特异着色特征

 

以下情况可干扰免疫组化标记结果的观察和判断:

(1)抗体交叉反应:  是由于该抗原决定簇同时存在于多种组织细胞,如GFAP可同时存在于星形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严重,可表达于多种组织细胞。因此,应全面了解和认识该抗体的功能和标记范围。故抗体交叉反应只要应用得当仍有助于诊断。

 

(2)非特异性染色  是指抗原无明确定位,肿瘤细胞与间质细胞、细胞与间质均为黄色,相互累及一片,色度无深浅之分。这种标记组织片不能作为免疫组织标记结果判断依据。

非特异性染色的原因常为组织标本固定不佳、抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。因此,免疫组化特异性染色定位非常重要,如前所述,阳性颗粒应位于细胞胞膜、胞浆或胞核,阳性细胞与阴性细胞相互交杂,阳性染色强度深浅不一。如果缺乏细胞间的不均一性染色,即是呈阳性染色,常提示为非特异性染色。

 

免疫组化结果的判断原则及对假阴性和假阳性的认识

 

一、 免疫组化结果的判断原则

免疫组化具有特异性强、敏感性高及定位正确等优点,但随着免疫组化应用的普及和深入,越来越多的问题也随之出现。因此,掌握对免疫组化结果的判断原则是很重要的。

  1. 必须设染色对照  每批染色都要以特异性的阳性对照和阴性对照为基础,才能对染色结果做出正确的判断。没有阳性对照,就不能做出真正阴性结果的判断;同理,没有阴性对照,也就不能做出真正阳性结果的判断。因而,没有对照的免疫组化染色,即使做出了判断也是不可信的。
  2. 抗原表达必须在特定部位  阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性,如LCA在细胞膜上、Keratin在细胞浆内、S-100蛋白在胞浆和胞核内,EMA在细胞膜上。不在抗原所在部位的阳性表达一概不能视为阳性。
  3. 阴性结果不能视为抗原不表达  即阴性结果不能认为具有否定意义;阳性表达有强弱、多少之分,哪怕是只是有少数细胞阳性(但要在抗原所在部位)也要视为阳性表达,不能认为个别细胞阳性而不作阳性看待。
  4. 免疫组化与HE切片诊断应以HE切片诊断为准  当免疫组化诊断结果与HE切片诊断不一致时,应再结合临床资料、X线等影像学及实验室结果综合分析,不能用免疫组化检查结果推翻HE切片诊断。

 

二、引起假阴性和假阳性结果的原因

 

1.假阴性结果的原因主要是:

(1)抗体已失活或浓度不当或抗体本身达不到应有的敏感度;

(2)由于组织自溶,抗原扩散而导致抗原消失,特别在长期固定的标本中因抗原漏出而致假阴性,因此应多用新鲜固定之标本;

(3)操作步骤不当,如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高;

(4)组织或细胞中抗原的含量很低,所用的方法难以检测到,如用直接法检测为阴性,但改用间接法时则为阳性。

2.假阳性结果的主要原因是:

(1)所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应,特异性差,特别在应用多克隆抗血清时更易出现;

(2)所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥导致抗体与组织产生非特异性结合;

(3)组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色;

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