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酵母实验操作方案

  

一.质粒酶切及线性化

1)用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2,可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液,终体积80ul。

2)线性化质粒

使用80μl酶切体系

9KSF2质粒                   70μl

内切酶(SacI, SalI, BglⅡ)     2μl

10 x buffer        8μl

3)酶切3-16小时,一般3小时即可;

二.乙醇回收酶切质粒

1)2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC(PH 5.2),混匀,沉淀DNA;

2)-200C数个小时(>2小时),13,200rpm离心10~20分钟,吸弃上清;

3)300ul 70%乙醇洗一次,13,200rpm离心10分钟,吸弃上清(注意离心管位置,从含有DNA的离心管另一侧吸取);

4)37℃烘干水分和残留乙醇;

5)用20μl ddH2O重溶;

6)1ul样品电泳检测DNA量,计算DNA总量;

三.电转化

1.准备感受态细胞

1)5ml YPD 接种GS115单菌落,250rpm,300C,摇菌24 hours;

2)100ml YPD,接种百分之一,同时留1ml空白YPD,300C ,250rpm,7~8hours,直到OD600=1.3~1.5;

3)菌液转入500ml离心管,JA14,1500g,40C离心5 min,弃上清;

4)100ml冰水重悬,同上离心,弃上清;

5)80~90ml冰水重悬【50ml】,同上离心,弃上清;

6)20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】,然后转移到50ml 离心管中,同上离心,弃上清;


7)约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】,40C备用,剩下的感受态细胞可以保存在-700C冰箱大约3周。

酵母 实验操作
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