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原核表达--表达前的分析比什么都重要

  

表达不同于其它一些实验,比如:提取质粒、PCR、电镜切片,这些人为控制的因素比较多,出问题相对来说也比较好分析。表达呢,你把质粒克隆好啦,交给细胞,然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。原核表达在表达当中来说还是比较简单,细菌培养条件简单、生长速度快,需要的仪器和培养基都比较便宜。当然,它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。

原核表达从一开始的设计就非常重要,所谓好的开始是成功的一半。做足准备功夫,可是省去很多将来后悔的事情。首先,我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类,如果希望可以同时尝试多种表达系统,也有许多商业化的系统供选择。

前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系,现在我想先从自己的蛋白分析讲起。同样的载体、同样的系统,很可能表达这个蛋白表达量奇高,但是另外一个就是做不出来,所以没有万能的载体,只有永恒的分析。当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的,选择同样的载体表达成功率会高很多。如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。根据经验而言,含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。

在下面将列出几个影响表达的因素,大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下:

1.翻译起始位点

现在大部分的表达载体都提供起始位点,所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了,一般情况下不需要自己再加,不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子

2.GC含量

表达序列中的GC含量超过70%的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等软件进行预测。

3.二级结构

在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用软件分析DNA或RNA结构上有柄(stem)结构,并且结合长度超过8个碱基,这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定。

4.基因或者蛋白的大小

一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小,越容易被降解。在这种情况下可以采取串联表达,在每个表达单位(即单体蛋白)间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小,那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠,并以融合形式表达。

对于另一个极端,大于60kD的蛋白建议使用较小的标签,如6×组氨酸标签。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取,如果是要进行抗体制备而截取,那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析,比如Vector NIT Suite或者一些在线软件,不过在分析之余也要认识到这是一种数据统计的结论,如果蛋白和免疫动物亲缘关系较远的话还是不妨一试的。

5.亲疏水性

这也是一种经验之谈,相信经常做表达的人都发现表达亲水区域时表达量会比较高,如果你要表达一个膜蛋白,那么劝你做好长期抗战的准备吧。有许多软件可以对氨基酸的亲疏水性进行分析,比如Vector NIT Suite,除此之外还可以利用在线跨膜区预测软件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 对跨膜区进行预测。

对于自己表达的蛋白有所了解后就可以开始对载体进行选择了,目前商业化的载体基本上包含以下几个元件:

除了上面标出的元件外还需要有复制起点,它对于控制质粒的拷贝数非常重要;另外就是筛选标记了,比如蓝白斑筛选的lacZ,各种抗生素标记。在以上几个元件中,我们需要注意的是负责调节与启动的元件,也就是调控子和启动子。其中启动子对于蛋白表达的速度起着举足轻重的作用,它与最终蛋白的表达量、是否可融密不可分。这里,对于世面上广泛销售的几种原核表达载体使用的启动子进行总结。

 

启动子

来源

调控手段(浓度)

强度

LacUV5

乳糖操纵元

lacI/IPTG (0.1-1mM)

Trp

色氨酸操纵元

trpR 3- β - 吲哚丙烯酸

Tac

结合了色氨酸启动子的 -35 序列和乳糖启动子的 -10 序列

lacI/IPTG (0.1-1mM)

PL

λ噬菌体

λ cI 阻遏物 / 温度

噬菌体 T5

T5 噬菌体

lacI/IPTG (0.1-1mM)

pBAD

阿拉伯糖操纵元

AraBAD/ 阿拉伯糖( 1 μ m-10mM )

严谨

T7

T7 RNA 聚合酶

lacI/IPTG (0.1-1mM)

非常强

原核表达
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