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Pichia酵母表达系统使用心得

  

甲醇酵母表达系统有不少优点,其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知,并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高,但是在实际操作中,并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题,收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学(Georgetown University)Lombardi癌症中心(Lombardi Cancer Center),部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点 与其他真核表达系统比较 与原核表达系统比较
1.属于真核表达系统,具有一定的蛋白质翻译后加工,有利于真核蛋白的表达优点 - +
2.AOX强效启动子,外源基因产物表达量高,可以达到每升数克表达产物的水平 +++ +
3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物,远较真核系统简单,非常适合大规模工业化生产。 +++ =
4.可以诱导表达,也可以分泌表达,便于产物纯化。 = +
5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物,部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源,生产成本低 +++ +

+ 表示优胜于;- 表示不如;= 表示差不多

EasySelect Pichia Expression System

产品性能:

优点――使用简单,表达量高,His-tag便于纯化

缺点――酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题

全面产品报告及心得体会:

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种,一方面由于其是属于真核生物,因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰,另一方面毕赤酵母生长速度快,可以将表达的蛋白分泌到培养基中,方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点(MCR)3'端带有his-tag和c-myc epitopes,这些tag有利于常规检测和纯化,而且在MCR5'端引入了alpha factor(α-factor)用以增加表达,并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候,如果你选择的是EcoRI,那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记,而诱导表达的载体需要甲醇――甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。

第一步――构建载体

Xiang Yang:pPICZ系列有许多克隆位点可供选择,同时也有三种读码框以便不用的用户需要。

红叶山庄:有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列?pPIC9K属于穿梭质粒,也可以在原核表达,而pPICZ系列比较容易操作,大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin筛选(PIC9K操作麻烦一点,大肠用amp抗性,而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆,在利用G418筛选多拷贝),而且对于大小合适(30―50KD)的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。

leslie:要做毕赤酵母表达实验,首先当然就要了解这个可爱的酵母了(椭圆形,肥嘟嘟的,十分可爱),她和大肠杆菌长得有较大区别(大肠杆菌是杆状的),因此在培养的过程中要区别这两种菌体,除了气味,浓度,颜色以外,也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧,表达过程中染菌(我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌,那真是一段可怕的经历),如果在不知情的情况下继续做下去,那可以就是浪费大把的时间了。

基本熟悉了毕赤酵母,了解了她生长的喜好(多糖偏酸环境),生长的周期等等情况后,当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上,我的表达蛋白有些恐怖,有100KD,本来当然应该放在大肠杆菌中表达,但是为了分泌表达(其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错)和糖基化修饰(主要是这个方面,因为我的蛋白是人源的,表达出来用于酵母双杂,因此需要有完备的糖基化修饰)。这样我的DNA片段由于较长,所以在做克隆的时候也要非常小心,需要注意的是:

①酶切位点不能出现在目的DNA片段中――如果片段长无法避免,可以采用平末端连接;

②虽然α-factor可以自动切除,但是在设计表达的时候,如果在N端不能出现任何多余的aa(比如药物蛋白表达),需要特别留意(说明书上有详细说明:P13);

③有三种不同的读码框(对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列),在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确,这可是致命的问题;

④无论pPICZ还是pPICZα都有TGA(终止密码子),但是pPICZ系列没有ATG(起始密码子),有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利;

⑤如果不希望有c-myc和His-tag,可以在基因片段末尾加入终止密码子;

⑥Pichia的密码子与酿酒酵母的相似,有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换,有人认为一定要换,个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子,而如果片段过长就比较麻烦,不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的;

⑦克隆菌株需要有recA,endA,试剂盒带有的TOP10挺好用的(其它像是DH5α都行),但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基(NaCl减半),这主要是因为怕影响到抗生素作用(Zeocin平板要避光保存);

⑧测序引物可以用α-factor信号引物,也可以用5'AOX1引物;

⑨如果需要高量表达,可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达,另外也可以在转化酵母的时候重复转化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列,因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物,会影响表达,另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列(x=任何氨基酸),因为这些序列容易受到容酶体的切割,而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser这样的氨基酸。除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,也需要多加注意。

酵母表达
相关参考
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