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蛋白质组在各个行业中的应用

  

随着各项基因体计画完成,所有的资讯也会储存于资料库当中;这些不同基因体之表现型 (phenotype) 之比较,将会是一个新的里程碑。过去之研究都是从型态上观察各个组织细胞间的差异,进而找出不同的基因;在未来则是利用完成定序之各基因体,进而研究其表现于细胞的功能,因此 proteome(蛋白质组)分析也成为蛋白质研究重要课题之一。

蛋白质组研究以高解析度、高效能的二维电泳(2-DE)、影像分析、质谱仪(MS)结合生物资讯学来分析、定量及鑑定蛋白质。由蛋白质的分析结果我们可以瞭解蛋白质在细胞内不同位置的表现、调节、活性、功能及交互作用;经由比较各细胞不同发育期之间蛋白质表现的差异性,我们可以探讨生物的代谢途径及致病机转,找出疾病的病变蛋白质,研发新的诊断标记或进行新药开发…等等(6)。以下分别说明蛋白质组研究的应用:

1.诊断标记(Diagnostic markers)及肿瘤标记(Tumor markers)

1-1感染性疾病

将基因体或是由所取得的检体利用蛋白质组技术将其展现出来,可以对此生物功能获得较全面性资讯。当人类得到某种感染性疾病时,利用被感染者的血液或病变细胞当作检体,以蛋白质组方法分析与控制组间之差异性蛋白,筛选感染性微生物之标的蛋白质,利用这些标的蛋白质探讨其感染及代谢途径或是製造出诊断性抗体,相信这将成为研究感染性疾病的新标准模式。

    台湾在1998年爆发肠病毒大流行,严重威胁台湾民众的健康及生命安全,即使到今日,肠病毒感染仍是令人闻之色变。根据调查研究,在台湾肠病毒引起的手口足病(HMFD, Hand-mouth-foot disease)及中枢神经病变,以肠病毒71型(Enterovirus 71)的比例最高;虽然可以利用取病人的血液或脑嵴髓液以分子生物学(例如RT-PCR)的方法诊断,也有相关的肠病毒基因晶片来侦测肠病毒;但若能以蛋白质组技术探讨病毒在感染过程中表现之标的蛋白质,并利用此标的蛋白质发展预后诊断试剂组(Prognostic kit),建立抗肠病毒71型的药物筛选模式,相信更有助于肠病毒的治疗、诊断及疫情监控。

1-2   体液性疾病

蛋白质组可以用来分析体液中的特殊蛋白质,蛋白质组学可以用来分析体液中特殊的蛋白,来解说在疾病诊断上之影响,有助于对疾病成因之瞭解、病程之控制与研判预后之结果。在一些患有脑膜炎、头部外伤、急性呼吸窘迫、肾功能不足、溶血性贫血或痴呆症病史的病人,这些病史都和体液中总体蛋白质的研究有关,将可用来发展一些较快速简易的诊断方法。患有脑膜炎或是头部外伤的患者,可以取其嵴髓液,透过双向电泳技术来鑑定蛋白质型态,尤其是嵴髓液中的血清输铁蛋白的后修饰作用。患有呼吸窘迫的病人,因其胸腔充满液体而压迫到气管,可经由胸腔穿刺吸出该液体后便可减轻患者的症状,再利用双向电泳技术分析体液的成分。但是目前对患有淋巴瘤病人身上的溶血性贫血症则难以侦测出来,因为其免疫球蛋白的轻链相当地少;而患有家族性淀粉样变性的病人,也很难诊断得出肾功能不足,因其许多的单株 IgA 的重链被水解之故,这些都可以透过双向电泳技术来分析检验之。目前对患有快速痴呆症者,可以在其嵴髓液中,检验发现两种不正常的蛋白 (命名为 130 和 131),最近被确定为 Tau g chain,此为临床上 CJD 所特有的病徵。由此更可知蛋白质组学在新的疾病指标或疾病模式的发现上,所扮演的重要角色。

蛋白质组学的研究也可以帮助我们去寻找新的疾病指标,相信在不久的将来,甚至可在嵴髓液或血液中侦测出 prion 蛋白质。整体性的测量嵴髓液中所缺乏的正常脑部蛋白,将有助于监测疾病的进程,更进一步有助于疾病的治疗。


 
1-3   心血管疾病

扩大性心肌病变(Dilated cardiomyopathy, DCM )是一种严重的心脏疾病,也是现代繁忙的都市人经常罹患的疾病,最后将导致心脏失去功能;病人通常都只能期待换心以维持生命。运用蛋白质组的方法已经鑑定出心肌中150种蛋白质,比较后发现有25个蛋白质有明显的差异;经由这些已确认的蛋白质资料库与病人(或高危险群)的蛋白质做比对,或许可以在疾病产生初期达到早期预防的目的。

1-4   癌症医学研究方面

根据卫生署公佈的资料,癌症已经连续多年高居国人十大死因的首位,平均每17.5分钟就有一个家庭因为癌症而面临死别的伤痛。由过去的研究资料显示,超过50﹪的癌症与p53的变异有关(p53是一种抑癌蛋白质),蛋白质组分析方法能够分辨出蛋白质分子结构上轻微的变化;经由p53的蛋白质组学研究,更可以釐清p53异常所造成细胞的调节缺陷及凋亡(Apoptosis)的机转。

虽然目前在临床上已经发展出许多肿瘤标记,例如CEA、CA125….等可供利用,但是碍于专一性及准确度不高,并无法十分精确的应用在癌症的诊断上,大多数都用来做为癌症治疗及预后的指标;蛋白质组方法进行肿瘤研究可能可以发现新的肿瘤标记并建立肿瘤或癌症的2D资料库。

1-4-1 乳癌 (breast cancer)

在比较人类正常乳房组织与恶性乳房癌的蛋白质分佈中,发现两者之间有专一性的蛋白质差异存在。在肿瘤细胞中,至少有 22 种蛋白质会不正常的增加,一种蛋白质则会减少。另外也发现到某些特定的蛋白质的表现与 estrogen 与 progesterone 接受器之间有相关连性。

1-4-2 肺癌 (lung cancer)

肺癌是最具肿瘤性 (oncological) 的疾病之一。临床上肺癌的诊断往往已属晚期。直至目前为止,并无有效的治疗方桉可得。所以任何有助于肺癌诊断或预后的发展都是有助于肺癌的治疗方针的。也因此,有许多的科学家是致力于以双向电泳技术研究人类肺癌的。在分析组织病理学上不同种类  (histopathological types) 的肺癌细胞时,结果发现不同组织病理类型细胞体会有不同的蛋白质表现图谱。另外,也发现有一专一性的蛋白质仅会出现在原发性肺腺癌 (primary lung adenocarcinomas)上。例用此技术将可有效地鑑定出新的肿瘤标志 (tumor marker),在鑑别诊断麟状上皮细胞肺癌与腺癌时有相当大的助益。

1-4-3 结肠癌 (colon cancer)

结肠癌是一种常见的癌症。虽然临床有 Dukes 氏分类与分级法,但对于癌症的发展程度和预后却仍难评估。为了寻找新的结肠癌抗原或标志 (marker)。利用双向电泳与免疫转渍技术,分析自人类结肠癌细胞粗萃取蛋白质中分离出的一系列蛋白质。并将有意义之蛋白质点 (spot) 切割出,进行蛋白质序列分析以鑑定这些蛋白质。曾有研究针对人类结肠性疾病,使用单株抗体分析结肠 heat shock protein 表现的情形,结果发现 hsp 70 酸性的 isoforms 在结肠息肉 (polypous) 与恶性组织 (malignant tissues) 中的表现不论是在量上或质上均有相当的差异;此外在慢性发炎性肠炎的黏膜或 Crohn's 肠炎组织中则有不同的 hsp 70 硷性 isoform 被发现。

1-4-4 肾脏癌 (kidney cancer)

人类的肾脏癌是较少见的癌症,其中源自于近端肾小管上皮细胞的肾细胞癌 (renal cell carcinoma) 大约占成人恶性肿瘤的 3 %。但如同许多实质性肿瘤般,肾细胞癌发现时期均属癌症末期,外科手术已难治癒的阶段。并且无适当的肿瘤标志可参考。在研究肾脏癌组织的研究中发现有四种蛋白质的表现在肾癌细胞中会消失。其中有两种蛋白质分别为 ubiquinol cytochrome c reductase, mitochondrial NADH-ubiquinone oxido-reductase complex I。这暗示粒线体功能的缺失在肾细胞癌的发生上扮演种要的角色。虽然该研究没有发现特定的标志蛋白质。但尚有许多可能与该癌症发生相关的蛋白质仍待被鑑定。

1-4-5 转移的潜力与癌症的治疗 (metastatic potential and cancer treatment)

直至目前为止,评估肿瘤细胞是否具有转移的潜力仍是不容易。但肿瘤细胞转移与否对于治疗方针的选择与预后是相当重要的。因此转移潜力的评估是研究的新方向之一。 Schwalke 等人曾利用双向电泳的策略分析具有转移潜力的胰脏细胞癌细胞株的蛋白质表现。同样的,Osada 等人也以双向电泳的技术研究 E-cadherin 在肝细胞癌 (HCC) 中的肝内转移性上所扮演的角色为何。至于癌症治疗的发展上,Weinstein 等人曾建立了以 information-intensive approach 作为癌症的分子药理学研究基础。主要针对 60 种人类的细胞株,分别处理 60,000 种以上的化合物,目的在筛选出能有效抑制细胞株生长的分子。接着应用双向电泳分析观察各种细胞株对各种化合物处理后的蛋白质表现图谱。目前约 60 种细胞株的双向电泳资料库已被建立。这不但有助于了解药理分子对细胞内蛋白质组的整个变化,也将提供癌症治疗新方针的依据之一。

1-5 免疫性蛋白质 (immunogenic protein)

自整个基因体或是组织中所抽取的粗萃取物,利用蛋白质组学技术将其展现出来,可以对生物现象获得一全面性的资讯。最佳的例子便是免疫系统辨认出感染性疾病中的标的蛋白质。当人得到感染性疾病时,利用其血清来筛选感染性微生物之蛋白质,进而找到主要的致病性蛋白质。利用这些蛋白质可以製造出强有力的疫苗,相信这将成为研究感染性疾病的标准方法。这些相关的资讯可以利用双向电泳图谱来分析。另一个相关的领域是在过敏疾病的研究,尤以之花粉的免疫性研究已较清楚,并可对过敏病人进行减敏治疗。此外如医学上普遍使用的乳胶手套所造成的过敏,研究者可以直接地萃取出重要的致敏性蛋白质,研究其功能与结构并进一步藉由分生技术探讨其过敏机制。作者研究室目前则致力于霉菌及海鲜类致敏性蛋白质之研究,希望未来能发展出控制过敏疾病之新药物。

1-6 体液中的醣蛋白

在疾病发生时,常伴随有醣蛋白的修饰作用发生,如癌症、发炎反应、酒精中毒等等。双向胶体电泳可供分析体液或血液中的醣蛋白之一些微异质性 (microheterogenecity),在最近的研究中,由醣蛋白图谱鑑定出一些新的醣蛋白,包括 Apo J, clusterin, SP-40 等四十个蛋白。同时,结合双向电泳和 lectin affinity blotting 的技术也可以让我们来了解正常人的血浆/血液中醣蛋白的特殊组成或变化,例如分析胎儿和婴幼儿的血浆/血清蛋白图谱,并和成人的图谱比较,则至少有十个不同处被鑑定出来。

在许多疾病中醣蛋白图谱的变化是一极具再现性及非常容易操作的方法,例如研究 CDG (carbohydrate-deficient glycoprotein) syndrome 发现所有N-link 醣蛋白多出了一些高 pI 值的 isoform,此外研究 CDG syndrome 病人血清醣蛋白及其在肝中前驱物发现缺乏 Apo J 和血清 amyloid P 蛋白。这血清醣蛋白图谱显示不正常的 isoforms,例如质量下降,并且朝向阴极移动。此外,研究风湿性动脉炎,心肌梗塞,癌症病人及健康自愿者的血清中之 a1 酸性蛋白的微异质性。经由双向电泳的分析发现,所有样品之 a1 酸性醣蛋白的电荷有明显的差异且在癌症病人中有较高的表现量。

2.生化毒理及药理学研究方面

许多生化分子藉着讯息传导(Signal transduction),经由蛋白质的调节作用,例如磷酸化、去磷酸化、甲基化....等,引发一连串的生化反应;某些药物在人体内的传送及代谢也是藉着与蛋白质(例如Albumin)结合来进行;这些代谢机转及作用模式都非常适合使用蛋白质组学来研究及探讨。将某一特定细胞株经药物处理后,比较此细胞的蛋白质组在加药前后的变化,探讨此药物的作用及代谢模式,有助于新药的开发。

Weinstein等人针对六十种人类细胞株以60,000种以上的化合物处理,筛选出抑制细胞株生长的分子,并以蛋白质组研究方法观察各个细胞株在以各种化合物处理后的蛋白质表现图谱,建立2D资料库,这除了有助于瞭解药物对细胞内蛋白质组的变化外,也提供癌症治疗的方向。

2-1 磷酸化作用 (phosphorylation)

在许多的生化反应中,讯息的传递是藉由胜汰 (peptide) 的磷酸化或去磷酸化。某些药物的药理功能或是某些毒性物质的致毒性即来自于其可调节或改变这些磷酸化或去磷酸化。

药理学和毒理学中,有些研究利用双向电泳去分析蛋白质磷酸化或去磷酸化,例如 cytokines 与 receptors 的相互作用,其间的讯息传递包括了数个磷酸化蛋白质。Bistratene A 可改变人类血癌细胞中蛋白质磷酸化的模式。许多荷尔蒙可启动细胞中磷酸化或去磷酸化的讯息传递。在绒毛膜组织中,绒毛膜促性腺激素 (chorionic gonadotropin) 的形成包括了蛋白质的磷酸化。

2-2  药物代谢物和运送 (drug adduct and vehicles)

药物或药物的代谢物,如磷酸根或醣基,可与蛋白质共价结合,改变其一级、二级和三级结构。为了研究这些效应,必须去鑑定其被修饰过的胜汰。利用蛋白质组分析是一个很好的研究工具,例如 acetaminophen 为一种普遍使用的止痛药和退热药,其大量使用时会危害肝脏且可能致命,但其m-hydroxy isomer不会危害肝脏,两者皆可被肝的 cytochromes p450 氧化,与肝的蛋白质共价结合,因此可利用双向电泳方法研究比较两者的差异。

药物在血液中运输常常是与蛋白素 (albumin) 或醣蛋白结合。某些药物可与之共价结合,因此药物被吸收利用的量会减少许多,例如 penicillin 会修饰血清中的蛋白素。为了增强药物的投递和改善其运送,必须有药物携带者 (drug carriers),如胶状携带者或微小粒子 (nanoparticles)。利用蛋白质组的方法可有效的追踪和鑑定血液蛋白质与这些人工合成粒子间的交互作用。例如利用双向电泳分析表面以 latex 修饰过的粒子其在血液中被蛋白质吸收的模式。有些 apolipoprotein 在 reticulo-endothelial 系统吸收这些粒子中扮演重要角色,实验証明这些 apolipoprotein 确实可吸附于微小粒子表面。

2-3 荷尔蒙 (hormones)

产科学和妇科学中,有些荷尔蒙可用于避孕和不孕上。科学家利用蛋白质组的方法研究荷尔蒙处理后整体蛋白质的表现情形。高量的 ethinyl estradiol-norgestrel 可用于紧急避孕法,其可有效抑制子宫内黄体酮连结子宫内膜蛋白质 (progesterone-associated endometrial proteins),改变子宫内膜的环境使之不合适于早期胚胎的生存。

3.在农业生物技术方面

由于基因工程技术的发展,高经济价值的农产品及基因食品大量的被製造及推广,提昇农业的价值及产能,有助于解决粮食危机。然而,经由遗传工程製造出的农产品(或食品)经食用后对人体是否会造成伤害,在人体内是否会产生不良的反应仍有许多值得探讨及釐清之处;藉由农业蛋白质组学的研究可以深入的探讨複杂的生物农业问题,追踪基因转殖品的后续变化,评估对人体及环境生态上所造成的影响。

4. 其它方面

4-1 追踪複杂 (tracking complexity)

蛋白质组学分析法可用来研究寄主-病原菌或寄主-寄生物之间的作用关係。豆科植物与根瘤菌共生而形成根瘤,以进行固氮作用。不同菌株具有不同的固氮能力,所以利用蛋白质组学技术可以瞭解何种分子对于固氮作用是最重要的。另外,可由有无形成根瘤之植物,而找出形成根瘤的相关蛋白质。于澳洲国立大学得研究显示,在亚麻感染的模式中发现,具致病性的的真菌其蛋白质有不同的表现情形。因此,藉由蛋白质组学之研究可以深入地瞭解複杂的生物性课题。

4-2  提升农业产品 (improved agricultural products)

传统农业是一门经验性的科学,即使在基因运作的规则尚未被瞭解之前,在植物或是动物的育种方面就已经有高度建构的成就。于过去的数十年间,在基因转殖技术的引导下,以使得农业进入了生物技术的革命性时期。以生物工程的技术增加植物对病原及寄生虫,如病毒,细菌,真菌或是昆虫的抵抗力就是一个很好的例子。相对于 mRNA 的大量表现,大多数的抵抗机制都涉及毒性蛋白或是保护性蛋白的表现。这些蛋白质的表现对于该保护作用而言是必须的,如马铃薯的抗病性。但如果没有即时地运用蛋白质组学技术来辅助新的毒性蛋白的发现,或是用来确认植物对于病原可能的抵抗性,也就是在基因转形的早期阶段大量地表现相关的蛋白质,则目前的成就真是一件令人惊讶的事。以现在许多农产品为例,其高附加价值的本质特性在分子层次上仍未被瞭解,而这样的表现型可能是起因于多种蛋白质表现的结果,而非单一基因产物所造成的。以木材为例,其外貌如色泽,纤维强度等都是重要的经济性特质,可以藉由树木蛋白质组学技术来确认影响这些特质的相关蛋白质,甚至可以更进一步地发展种子育种或是以分子生物学的方法来改良这些产品。

4-3  增加农产品价值 (value added agricultural products)

随着能产品市场的国际化以及产能上的压力,必须对于农产品的处理程序做一个全盘性的回顾。从前看来低价值的副产品,在今日全部被重新评估是否具有发展成新产品的潜力。而已有的产品也同样地再审视是否有更佳的处理程序。目前三种最迫切的农业便是酪农业,屠宰业与穀物。这三类产品在生产的过程中都会产生数以吨计的低价值性副产品,而这些副产品一般不是丢弃就是花钱请其他单位代为处理。详细地分析这些副产品的蛋白质成分与利用生物科技来增加其利用价值似乎有点令人惊讶,但这确实是有其必要的!

在酪农业中主要的蛋白质副产品来自于乳酪製造商。目前利用蛋白质组学技术发现在乳酪中有生长因子的存在,有可能成为具有促进生长的重组蛋白质的产品,或是应用在发展促进伤口癒合的製剂,如各式的溃疡药剂。而这些新的利用价值,甚至可能改变整个乳酪製造业的经济型态。

屠宰业在传统上会收集动物的血,骨头以及内脏来做为肥料。但是血清中含有超过两千种以上的蛋白质,其中已知生理功能的却仅有数百种而已!因此利用蛋白质组学技术的研究将可能导致许多新高价值蛋白的发现,而赋予肉品业的副产品有更高的价值。

食品业一直相当重视加工食品,而此类食品的製造需要有温和不刺激的蛋白质来源。一般最常使用的是牛奶中的酪蛋白,但是原料价格高。如果能直接利用穀类来抽取,那将是一个相当可观的市场。不过在这之前,应该先彻底的研究穀类蛋白质的特质,才能合理地发展这方面的应用。目前正研究积极方向的便是双向电泳技术应用于穀类粗抽蛋白质的分析。

相关参考
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