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溶菌酶的制备、纯化和鉴定

  

实验原理

溶菌酶,全称为1,4-β-N-溶菌酶,又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶,属于α-乳白蛋白家族。人们对溶菌酶的研究始于上世纪初,英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶;此后人们在微生物、植物、无脊椎动物和高等动物中也发现了溶菌酶的存在。其中鸡蛋清溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛。另外随着基因工程技术的发展,通过人工合成基因,用微生物发酵生产人溶菌酶的研究也正在深入进行之中。
 
鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白,单一肽链,分子量为14388,分子内含有4对二硫键。由于其含的碱性氨基酸残基比酸性氨基酸残基多,所以它的等电点高达11左右,等电点约为10.5~11,最适温度为50℃,最适pH为6~7左右。鸡蛋清中的溶菌酶的含量约占蛋白质总量的3.4%~3.5%。
 
溶菌酶既是药品又是保健品,还是生化药物中理想的药物酶,国外已经开始利用于药物制剂、食品和饮料的添加剂、生化试剂和医学诊断剂等。溶菌酶在医药、食品防腐和生物工程中应用非常广泛。溶菌酶是一种糖苷水解酶,具抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力等多种药理作用,临床上常用于五官科各种炎症、扁平疣、传染性软疣、寻常性疣等各种皮肤病的治疗,还可用于预防和治疗病毒性肝炎,尤其对输血后肝炎和急性肝炎的效果较为显著。另外人体溶菌酶还可作为多种疾病的诊断指标。

实验试剂

固体硫酸铵;10%硫酸铵;1mol/L HCl;1mol/L NaOH; 聚乙二醇;0.15mol/L pH 6.5的磷酸缓冲液;0.1mol/L HCl;0.025mol/L KCl-0.1mol/L HAc;30% Acr/Bis;10% SDS;1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8);0.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8);TEMED;10%过硫酸铵;5*Tris-Gly(pH=8.3)电泳缓冲液;2*样品处理液;染色液;脱色液

实验设备

精密pH试纸;布氏漏斗;磁力搅拌器;离心机;透析袋;玻璃层析柱Bio-Rad层析系统;Bio-Rad垂直电泳系统

 

实验材料

新鲜鸡蛋若干只;724型酸性阳离子交换树脂;Sephadex G-50 ;蓝色葡聚糖-2000

实验步骤

1 实验方法与步骤:
本实验主要采用了724型酸性阳离子树脂交换吸附,(NH4)2SO4盐析、ph调节等电点去除杂蛋白,凝胶层吸分离纯化,最后用SDS-PAGE鉴定纯化产物等方法。
 
1.1 溶菌酶的制备
    以蛋清为原料制备溶菌酶,采用树脂吸附法提取溶菌酶。因溶菌酶为碱性蛋白,在近中性环境中被阳离子交换树脂所吸附。利用该性质,可将它与鸡蛋中其他蛋白分离,然后再经(NH4)2SO4盐析、pH调节等电点去除杂蛋白纯化处理,所得到的溶菌酶即可结晶。
 
1、用1mol/L HCl浸泡树脂2h,用去离子水洗至近中性;
2、用1mol/L NaOH浸泡树脂2h, 用去离子水洗至近中性;
3、用0.15mol/L pH=6.5的磷酸缓冲液浸泡过夜,滤后备用;
4、将2-3枚新鲜的鸡蛋洗净,空干水,敲破鸡蛋小头,再在大头打一小孔进气,收集蛋清;
5、用灭菌的纱布过滤蛋清,称量重量,置4℃冰箱预冷1h以上;
6、在不断搅拌下,将蛋清加入处理好的树脂中(取相当于蛋清1/4重量的树脂);
7、大力搅拌(冰浴中)吸附2.5h,4℃静置;
8、次日,3000rpm离心15min,收集树脂,回收蛋清;
9、树脂先用去离子水洗至洗液无混浊;
10、再用等体积的0.15mol/L pH6.5的磷酸缓冲液搅拌洗涤15min(冰浴中),重复处理1次,最后一次滤除树脂水分;
11、树脂用等体积10%的(NH4)2SO4浸泡,搅拌洗脱,每次搅拌30min,抽干,收集洗脱液。再重复洗脱一次,合并洗脱液;
12、每83mL洗脱液中加32g磨细的固体(NH4)2SO4,在搅拌下缓慢加入,待(NH4)2SO4完全溶解后,4℃放置过夜;
13、次日,1000rpm离心15min,收集沉淀;
14、将上述沉淀用1mL蒸馏水分两次洗下,装入透析袋中;
15、置于4℃冰箱,用蒸馏水透析24h以上,其间多次换水;
16、取出透析袋中的透析液,用0.1mol/L HCl调整pH至4.6,离心,收集上清液;
17、其沉淀加少量蒸馏水搅拌;
18、用1mol/L NaOH调整pH到5.5,离心,弃沉淀,收集纯化液;
19、将纯化液装入透析袋,用研细的聚乙二醇脱水浓缩;
 
1.2凝胶层析分离溶菌酶
凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离目的。
 
20、用1mol/L NaOH调整pH到5.5,离心,弃沉淀,收集纯化液;
21、将纯化液装入透析袋,用研细的聚乙二醇脱水浓缩;
22、取一定量的Sephadex G-50于250mL烧杯中加入洗脱液120mL,置于室温溶胀2-3天,反复倾泻去掉细颗粒,然后减压抽气去处凝胶空隙中的空气;
23、取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上,在距柱上端约3cm处作一记号,关闭柱出水口,加入去离子水,打开出水口,液面降低至柱记号处即关闭出水口,然后用量筒接受柱中去离子水,读出的体积即为柱床体积Vt;
24、在柱中加入洗脱液(约1/3柱床高度),将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中,待凝胶沉积约1-2cm高度后打开出水口,流速一般用3-6mL/10min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕,注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口,静置片刻,等凝胶完全沉降,则接上恒流泵,用1-2倍柱床体积的洗脱液平衡柱子,使柱床稳定;
25、吸取柱上端的洗脱液(注意不要搅乱液面),打开出水口,使残余液体降至于胶面相切(足以不要干胶),关闭出水口,用细滴管吸取0.5mL(2mg/mL)蓝色葡聚糖-2000,小心的绕柱壁一圈(距胶面2mm)缓慢加入,然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中,打开出水口,等溶液渗入胶床后,关闭出水口,用少许洗脱液加入柱中,渗入胶床后,柱上端再用洗脱液充满后用3mL/10min的速度开始洗脱。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积即为外水体积。蓝色葡聚糖洗下来之后,还要用洗脱液(1-2倍柱床体积)继续平衡一段时间;
26、按22的操作方法加入溶菌酶样品溶液(0.5-1mL),以5min收集1.5mL/管的速度洗脱并收集洗脱液;
27、用Bio-Rad层析系统设置洗脱条件,进行洗脱,记录仪记录实验时检测到的洗脱液在A280处的吸光值,直接描绘出洗脱曲线。合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液,-20℃保存备用;
 
1.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶鉴定分离产物
SDS聚丙烯酰胺凝胶采用不连续缓冲系统,利用浓缩胶和分离胶浓度不同从而使分子量大小不同的蛋白质得以筛选。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度,凝胶的筛分特性取决于它的孔径,反过来孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。
 
28、确定所需凝胶溶液的体积,配置一定体积的分离胶溶液;
29、迅速在两玻璃板间的空隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需的空间(梳子的齿长再加0.5)。再在胶液面上面小心的注入一层水,以阻止氧气进入凝胶溶液;
30、分离胶聚合完全后(约30min),倾出覆盖水层,再用滤纸洗尽残留水;
31、配制浓缩胶,在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子,将凝胶垂直放在室温下;
32、在等待浓缩胶聚合时,可对溶菌酶样品进行处理,在样品中按1:1体积比加入样品处理液,在100℃加热5min后置于冰上,12000rpm离心3min,取10uL上清点样;
33、待浓缩胶聚合完全后,小心取出梳子,把凝胶板固定于电泳装置上,上下槽各加入Tris-Gly电极缓冲液;
34、将电泳装置与电源相接,调节电压为200V,电泳直至溴酚兰到达分离胶底部上方约1cm处,关闭电源;
35、从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板,必要时可切角作标记;
36、用染色液体对胶进行染色1-2h;
37、用脱色液对胶脱色1h,必要时更换多次脱色液至背景清楚,条带清晰;
38、脱色后,可以将凝胶浸入水中保存,或对凝胶进行拍照,或将凝胶干燥擦成胶片;
39、测量并计算溶菌酶分子量。

注意事项

要注意的具体事项和解决的问题很多,下面按照实验步骤顺序加以汇总:

第3步:磷酸缓冲液浸泡过夜时,大烧杯应加盖手套,可以防止蒸发。
第5步:纱布过滤前,最好先用玻璃棒搅匀蛋清,可以节省过滤时间。
第6步:树脂要先经布氏漏斗抽滤处理,得到干树脂加入蛋清。
第11、12步:直接合并洗脱液,测量体积,不要过滤。
第17-19步:去除杂蛋白时,pH测量要准确,调节要精细,因为多个收集管合并后,会因pH差异造成沉淀并产生不必要的电荷差异。
第23步:A)层析系统管道要用洗脱液先润洗1-2遍。
 B)洗脱液上柱前先要减压抽气,并提前准备。
C)加入洗脱液后,要随时观察液面变化,防止干胶。
第25步:溶菌酶上样时,吸取洗脱液到凝胶面处于干湿之间为最佳。
第26步:层析系统使用完毕,管道用20%的乙醇溶液润洗干净,日后备用。
第34步:电泳完毕,剥胶时可切一角作标记。

其他方面:
1.去除杂蛋白,调节pH至5.5时,NaOH最好使用0.1mol/L,这样调节起来比较精细,不会产生较大的pH波动。
2.利用凝胶上样平衡的1-2小时里,校正收集管体积,即调节Fix Size,如使1.55ml=1.00ml。
3.收集洗脱液时,可以每管1.5-2.0ml,以便于在紫外分光光度计上测量。(补充:如果要缩短洗脱时间,可以每管小于1ml,搜集完毕后从各管吸取250μl到96孔板中,用酶标仪一次测量完毕。)
相关参考
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