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各种蛋白质分离技术

  

1、各种蛋白质分离技术

平板凝胶电泳(Slab-gel electrophoresis)是一种蛋白质分离技术,其能同时分析一维的形式(1-D format)与解析大量的蛋白质在二维的形式(2-D format)情况。除此之外,对于需要特殊之仪器才能达到蛋白质分离的技术-高效液相层分析HPLC(Hight performance liquid chromatography)、毛细管电泳CE(Capillary electrophoresis) -而言,平板凝胶电泳相对上较符合经济效益。然而,平板凝胶电泳之成本较低,但是它在分离上有需多的限制,例如:对于疏水性与膜蛋白之溶解度限制大、受限的动力范围(dynamic range)、对于硷性或酸性蛋白质难以有效分离、低的敏感度与难以定量、无法自动操作等。另一方面,高效液相层分析、毛细管电泳在分离技术的限制上与平板凝胶电泳截然不同。


Function CE SGE( Slab-gel electrophoresis) HPLC
Automation speed Yes No Yes
Sensitivity nm-fematomole Slow,minutes-hours Minutes
Sample size nL μM μM
detcetion On-column Staning,fluorscence Off-column
Quantitation Yes,area under peak Possible,but not simple Area under peak
Multi samples Yes,96-384 capillaries Yes No
Multidimensional Yes Yes Yes


 

 

 

 

 

 

 

表 1:各种蛋白质的分离技术在功能上的比较(7)。

2、如何分离蛋白质

在此我们必须确定欲要分离的蛋白质是哪一种类型,大致有:来自于溷合物(cell lysate,cell culture susperntant,serum)中的单一特蛋白质、一群蛋白质或是一个细胞或组织中所有的蛋白质。因此就不同来源的蛋白质,有不同的分离技术,以及各技术间的结合而形成多维之方式(multidimensional approach)来分离蛋白质,或是选择何种分离的特性 来分离,例如:亲和力、等电点(Isoelectrophoresis focusing)、离子交换(Ion exchange)、分子排除(Size Exclusion)就显的重要。没有单一的色层分析(chromatography)或是电泳(electrophoresis)能完成具有複杂性较高的蛋白质之分离,因此必须将蛋白质分解成数个peptides,再分离会比较有利益,且能简化蛋白质于定性上的难度而能得到准确的结果。

3、不同蛋白质的分离

(1)特定蛋白质的分离(Selective separation of a specific proteins)

利用亲和性HPLC或CE(affinity HPLC or affinity CE)来达成一特殊的蛋白质分离。而亲合力的原理是以具有生物活性的物质结合至具专一与可逆性之欲要被分离的分子来完成。生物活性的物质有:抗体(antibody)、(金属)metals、醣结合蛋白(lectin)、concanvalinA、  生物素(biotin),适合体(aptamers)、RNA or DNA fragment等。至于特殊的蛋白质在分离上,HPLC方面其是以装有原料的管柱(column)之活性表面来吸引蛋白质分子而达到分离的目的,而CE则是以管柱表面具活性的部分来吸引蛋白质分子而达到分离的目的。来自于蛋白质溷合物(protein mixture)、血清、细胞溶解物(cell lysate)等欲分离样品,被注入至管柱,其后感兴趣的蛋白质分子被其亲和物质(affinant)抓住而其它的的化合物则经由管柱流出。图十是以antibody来做为生物活性物质而达成生物亲和性之色层分析(bioaffinity chromatography),而在感兴趣的蛋白质分被亲和物抓住后藉着改变缓冲液的性质、pH、离子强度、温度而将感兴趣的蛋白质洗出。

各种蛋白质分离技术

图1:利用抗体的亲合力抓特定的蛋白质(8)。

(2)、分离一群蛋白质(selective separation of a group of proteins)

能利用上述利之亲和性HPLC或CE(affinity HPLC or affinity CE)来达成蛋白质分离之外,还能逐步依照感兴趣的蛋白质的性质(例如:疏水性、电荷、极性、大小与键结特性)来改变实验情况。这些改变有(1)移动相的的性质,例如:梯度的斜率(slope of the gradient)、有机修饰物的百分率(% organic modifier)、缓冲液的pH、盐类的浓度、ampholite’s pH range。(2)管柱的形式,例如:RP(C-18),离子交换(ion exchange)、大小排除(size exclusion)、胶体过滤(gel filled)、常态相(硅石)﹝normal phase(silica)﹞、亲和性(抗体的种类、lectin、aptimers、metals、DNA等)。因此实验的设计通常依赖感兴趣蛋白质的疏水性、电荷、等电点或亲和性。例如:含有组胺酸的肽类(histidine-containing peptides) 对于铜有金属亲和性;又含有磷酸盐的肽类(phosphopeptides)对于镓有金属亲和性;Lectin则在对醣蛋(glycoprotein)有高度亲和性。

(3)、分离细胞或组织中所有的蛋白质(selective separation of all proteins in a cell or tissue)

必须以多维(multidimensional)的方式来分离细胞或组织内的所有蛋白质,即利用平板凝胶电泳、毛细管电泳、高效液相层分析多个方法来达成分离;或是利用同一个分离方式中不同的分离机制,例如:分割(partition)、吸附作用(adsorption)、亲和性、大小排除(size exclusion) 来达成分离。以2-D电泳分析 (2-D PAGE)为例子,在分离蛋白质分子时先以蛋白质的电荷做为基准(第一维),之后再以蛋白质分子量大小来更进一步分离蛋白质分子(第二维)。除了2-D gel electrophoresis之外,其它的多维的方式(multidimensional approaches)而使蛋白分离之方法,例如分析者能结合二种不同的HPLC(或CE)分离机制或结合平板凝胶电泳、毛细管电泳、高效液相层分析模式来分离蛋白质。分析者也能利用Reversed-phase HPLC之后紧接着HPLC或是CE之后紧接着Reversed-phase HPLC或是CZE之后紧接着IEF- CE。


SGE HPLC modes CEC mode CE mode
  Size HIC Reversed-phase HIC Reversed-phase     CZE
Charge Ion exchange   Ion exchange   IEF
  IEF Size exclusion Affinity Normal phase   Normal phase SDS-PAGE Affinity MEKC


表.2:各种不同分离机制相互结合而完成蛋白质分离的目的。

4、分离蛋白质的多维方法(Multidimensional separations of proteins)

(1)、二维电泳分析(2-D gel electrophoresis)

分离大量蛋白质时,我们通常採用2-D gel electrophoresis(研究蛋白质体学的必要技术),但在最近的研究中发现2-D PAGE和MS一同作用时,只能侦测出量大的蛋白质,但即使有缺陷,此技术仍是我们最广为使用的细胞或组织中蛋白质多维分离技术。从许多的实验室及疾病研究经验中也告诉我们2-D gel electrophoresis 和2-D maps比较起来是一个相当可靠的方法。

蛋白质被2-D gel electrophoresis分离染色后,gel上会有点显露出来,加入trypsin将蛋白质切成一段段的peptide fragments,MS会将一个个的fragment定量,我们就能和DNA或蛋白质资料库中的预测做比对,比较peptide fragments的分子量,以确定这是什麽蛋白质。

蛋白质体学目前受到2-D gels解析能力限制,如果我们用spot detection在标准的2-D gel format中可以看到3000-10000个proteins(即点),但这些点代表的是在每一细胞蛋白质族群中超过10000个分子的蛋白质,至于其他的侦测方法,也无法侦测低于每一细胞1000个分子的蛋白质,ex.Fluorescence,imidazole zinc,or silver staining。假设每一细胞有109个蛋白质分子和50000-500000个mRNA分子,一个mRNA又可以製造出许多蛋白质,我们暂定一个哺乳动物的gene平均在gel上产生五个点,每一细胞10000个active gene,就可以在gel上产生50000个点,所以我们在2-D gel上看到的3000-10000个点只不过是7-24%出现最丰富的蛋白质罢了。因此依此理论,76%的蛋白质都低于侦测限制,且大部分在每一细胞中不超过10000个分子。

(2)、高效液相层分析和毛细管电泳共用的多维分析( Multidemensional HPLC,CE and HPLC-CE protein/peptide separations)

分离细胞或组织中的所有蛋白质并不是一件简单的事情,人类细胞中有数以千计的蛋白质,经代谢后更会产生大量的peptides,要用单一的色层分析或电泳技术来分离这样大的一个複合物是不可能的事情,所以我们必须採用多维的方法;在2-D gel electrophoresis中,蛋白质是先被分离,再被trypsin代谢,最后peptide片段才被MS分析出来。但在色层分析和毛细管电泳的多维方法中,蛋白质是先经酵素作用然后才被分离,这麽做的好处是月生肽片段和完整的蛋白质比起来溶解度较高也较易分离,尤其是对厌水的膜蛋白而言,坏处就是我们必须解决数量更大的peptides。

5、利用高效液相层分析和毛细管电泳可增加蛋白质的浓度(On-column HPLC and CE protein concentration)

高敏度对蛋白质体学的研究是很重要且决定性的一点,HPLC和CE的优点是它们可以把稀薄的样品在分离前于管柱上浓缩,在HPLC稀薄溶液藉由动向的巧妙操作可以在分离前被浓缩于管住的顶端,CE则採取不同的浓缩方法,包括antibodys的运用、接上C-18、eletrophoretic techniques(ex.stacking)、IEF或isotachophoresis(ITP)。事实上蛋白质溷合物经愈多次处理损失愈多,CE适时提供一项优点,分析者可将细胞引入毛细管或微流管道,溶解细胞再分离蛋白质,所以我们可以除去管外操作时蛋白质流失的缺点。

6、侦测

不像2-D gel electrophoresis在侦测、定量已分解蛋白质还需要染色或其他的步骤,HPLC、CEC、CE技术中蛋白质和peptides可直接用UV absorption、fluorescence、MS on-line侦测,peptide bond CO-NH在185-220-nm波长有很强的吸光力,让我们侦测出蛋白质的存在,侦测敏感度在波长区间的底端增加,然而分析者应该小心选择不会吸收特定侦测波长的buffer。蛋白质和peptides结构中含有aromatic amino acid residue者可被UV absorption at 275-280-nm和fluorescence in the 200-300-nm波长区间侦测出,但用UV absorption侦测敏感度较高。

7、蛋白质的定量分析(Proteome quantitation strategies)

细胞或组织中蛋白质的定量并不是一件简单的事情,过去我们用2-D PAGE测量蛋白质在表现阶段时的变化(藉由比较点的明暗度),但如之前提到的,2-D gel这个技术缺乏sensitivity、reproducibility和quantitative precision,所以现今又发表了革新的技术来改善─ICAT(Isotope code affinity tags),如图11所示。

各种蛋白质分离技术

图2:The ICAT strategy for quantifying differential gene expression(10)

8、蛋白质的鑑定(Protein identification)

Gel electrophoresis通常用来做蛋白质的纯化与初级分析,未知蛋白质被gel electrophoresis分离后用MALDI-TOF MS做peptide mapping以快速鑑定,鑑定的方法通常都是拿被酶切断的蛋白质即peptide fragments和sequence database中的每一个蛋白质peptide fragments比对质量,通常都要得到好几个peaks才能确定它到底是哪一个蛋白质,有时候我们也会得到多于一个的解,据此我们自然就要用MS/MS得到的另外讯息来缩小搜寻,然而这需要更複杂更花时间的样品分析。虽然ESI-MS/MS比MALDI-TOF的信赖度高,但MS还是有它的短处在鑑别有相同分子量的amino acids如Q与K或E与N而导致peptide sequence有不正确的排列顺序。因此发展出了新的方法来解决此问题,其一用CE来做peptide mapping,此方法中peptide的迁移率依理论模型(以peptide width、charge、residue mass为基础)做预测,另外的方法就是Nanoelectrospray CE-MS,以electrophoretic mobility-assisted identification of proteins的原理达到,这个方法依据Offord发展出的理论模型,说明peptide的电泳迁移率和它的分子量与带电量有关,可以作为一个功能的选择,带电量上的差可以用来认出MS不能分辨的amino acid,如Q与K,而找出正确的peptide sequence辨认出该蛋白质。

相关参考
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