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亲和层析法蛋白质纯化

  

若表达蛋白质上含有一段六个His 的片段,而亲和吸附胶上接有镍离子,此蛋白质会特异性地结合到吸着胶体;洗去杂质后可imidazole 洗脱目标蛋白质。

实验设备:

亲和层析管柱 (Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm)

部分收集器 (另需准备干净试管约25 支)

蛋白试剂:

金属螯合亲和层析胶体 (Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210) 1 mL

◆ 在交联琼脂糖凝胶上接有nitrilotriacetic acid (NTA) 官能基,可以螯合镍离子;使用前先以镍离子饱和的。

Buffer B-300/0 (50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl)

◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol.

Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole

Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

纯化步骤:

1) 亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内,成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上,去除下方的填塞物,用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口,准备注入样本。

2) 除去胶面上方的缓冲液,并取出样本 (IEX) 使其回到室温,慢慢用滴管加到亲和胶体上,小心勿弄乱胶体表面;让样本没入胶体中,同时收集流出液每管2.5 mL.

3) 待样本全部进入胶体后,关闭出口,再慢慢加入buffer B-300/20,打开出口收集流出液;buffer B-300/20 共流洗30 mL.

4) 接着以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上,收集。

5) 所有收集均定量蛋白质并测定酶活性,取收集酶活性最高的数个,共得 _______ mL (AF),保留100 μL 以供分析。

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