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各种蛋白质提取方法大全

  一、植物组织蛋白质提取方法 
1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 
4、提取上清夜,样品制备完成。蛋白质提取液:300ml 
4.11Mtris-HCl(pH8)45ml 
4.2甘油(Glycerol)75ml 
4.3聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g 这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳! 
二、三氯醋酸—丙酮沉淀法提取植物组织蛋白质 
1、在液氮中研磨叶片 
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。
4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。药品:提取液:含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M的DTT65μl/ml。这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少! 
三、组织:肠黏膜
目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤:含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)倒转混匀,置室温10min 离心:12000 g,10min,4度,弃上清加入0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)振荡,置室温20min 离心: 7500g,5 min,4度,弃上清重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2次沉淀中加入100%乙醇 2ml 充分振荡混匀,置室温20 min 离心: 7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀 1%SDS溶解沉淀离心:10000g,10min,4度取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)存在的问题:加入1%SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶?测浓度,含量才1mg/ml左右。解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5-10分钟,效果很好的。
四、植物材料:水稻苗,叶鞘,根 
1、200毫克样品置于冰上磨碎 
2、加lysis buffer,离心,10000rpm,4度,5min取上清 
3、重复离心5min 
4、lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40 
五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1小时,4℃,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃温育30min,期间搅动几次,28度 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70度保存。
六、植物根中蛋白质的抽取 
1、sample,液氮研磨 
2、装1.5 ml centrifuge 用tube 
3、加 1M KH2PO4+K2HPO4 700μl 
4、12000 rpm,4度,10-15min 
5、取上层液,蛋白质就在里面
相关参考
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