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Western Blotting 各种问题及解决办法

  

问题

可能原因

可能采取的措施

背景高且均一

1.抗体浓度过高

降低抗体(一抗/二抗)浓度

2.封闭液选择不当

比较不同封闭液

3.封闭不完全

根据不同的体系优化封闭液

提高封闭物浓度

优化封闭时间和(或)温度,室温下至少1小时或4℃过夜

在封闭液中添加终浓度0.05%Tween-20

用含终浓度0.05%Tween-20的封闭液稀释抗体

4.抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应

更换封闭液

avidin-biotin系统避免使用奶粉,奶粉中含有biotin

检测交叉反应:封闭一张干净的不含蛋白的膜,抗体孵育后检测

5.清洗不充分

增加清洗次数及清洗液体积

如果之前未添加Tween-20,可添加Tween-20至终浓度0.05%

6.曝光时间过长

缩短曝光时间

7.膜出问题

确保转膜前,已根据厂商指导将膜彻底浸润

更换新膜

确保膜始终有足够的液体覆盖,避免干掉

避免徒手操作,应配戴手套,使用镊子

每一步孵育都应确保充分

8.缓冲液污染或长菌

重新配制缓冲液

背景高,且以斑点形式存在

1.抗体浓度过高

降低抗体(一抗/二抗)浓度

2.封闭液选择不当

比较不同封闭液

3.封闭不完全

根据不同的体系优化封闭液

提高封闭物浓度

优化封闭时间和(或)温度,室温下至少1小时或4℃过夜

在封闭液中添加终浓度0.05%Tween-20

用含终浓度0.05%Tween-20的封闭液稀释抗体

4.抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应

更换封闭液

avidin-biotin系统避免使用奶粉,奶粉中含有biotin

检测交叉反应:封闭一张干净的不含蛋白的膜,抗体孵育后检测

5.膜出问题

确保转膜前,已根据厂商建议将膜彻底浸润

避免徒手操作,应配戴手套,使用镊子

更换新膜

确保膜始终有足够的液体覆盖,避免干掉

每一步孵育都应确保充分

膜过多时,应避免相互堆叠

操作时应小心,对膜造成的损伤会产生非特异性反应

6.缓冲液污染

使用新的缓冲液

用前过滤

7.仪器污染

确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染

确保转膜后膜上没有残留的胶

信号弱或无信号

1.转膜效率低

转膜结束后,染胶以确定转膜效率

转膜时胶与膜应充分接触

确保转膜时滤纸与膜装配正确

按厂商指导将膜充分浸润

转膜体系在转膜过程中避免过热

使用阳性对照和(或)分子量marker

优化转膜时间和电流

确保在抗体杂交前的样品制备条件没有破坏样品的抗原性(注意:某些蛋白不能在变性条件下电泳)

2.蛋白与膜结合不充分

在转膜缓冲液中添加20%的甲醇

低分子量的蛋白使用孔径较小的膜

3.抗体量不足

增加抗体浓度

抗体可能已经失效,通过点杂交确定抗体活性

4.抗体浓度过高

抗体浓度过高会导致信号迅速减弱,造成信号弱的假象

5.抗原量不足

增加上样量

6.抗原被封闭液掩盖

更换封闭液

优化封闭液浓度

7.缓冲液中含有叠氮化钠

叠氮化钠是辣根过氧化酶的抑制剂

8.曝光时间过短

延长曝光时间

9.底物反应时间过短

延长反应时间至5分钟

10.底物失活

检查底物活性

确保两瓶底物之间没有交叉污染

11.剥膜造成影响

剥膜造成有些抗原丢失或变性,优化剥膜过程

仅在必需时剥膜重杂

避免反复剥同一张膜

12.膜上抗原降解

某些封闭物具有蛋白水解活性(如gelatin

13.转好的膜存放时间过长

重新电泳转膜

非特异性条带

1. 抗体浓度过高

降低抗体浓度

2.SDS造成非特异性结合

转膜结束后清洗膜

免疫反应过程中避免使用SDS

3. 二抗试剂的非特异结合

    更换二抗

4.一抗特异性差

采用单抗或亲和纯化的抗体

弥散条带

1.抗体浓度过高

降低抗体浓度

2.上样量过高

减少上样量

条带曝空或淬灭迅速

抗体浓度过高

降低抗体浓度,尤其是二抗浓度

仅局部区域有信号

转膜不完全

确保在胶和膜之间没有气泡

根据厂商指导将膜彻底浸润

避免徒手操作,应配戴手套,使用镊子

更换新膜

膜过多时,应避免相互堆叠

相关参考
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