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Western Blot中抗体相关的问题

  

1、做细胞信号传导,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?
解答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。

2、同一公司的不同抗体用某个稀释度对一种抗体效果好,另外一种抗体可不可以用同种稀释度进行稀释?
解答:不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀释度也是不一样的,需要进行实验摸索。

3、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗?
解答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。(限于单抗)

4、Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4℃保存,避免反复冻融。

5、做western每次只加一种一抗,可以同时加两种或者多种一抗的吗?
解答:最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话,就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片;漂洗以后,再上内对照的一抗、二抗,ECL显色、压片、洗片。 

6、酶显色与荧光显色之间,各自的优缺点是什么?
解答:免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原),然后与组织标本在一定条件下反应,如果组织中含有相应抗原(或抗体),抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时,能催化底物水解、氧化或还原,产生显色反应,这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质,通过图像分析并可达到定量的目的。

免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断,但是荧光抗体染色标本不能长期保存,对组织细胞的细微结构分辨不清,免疫酶技术则能克服上述不足,标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法,对石蜡切片标本尤为适用,为免疫病理研究开辟了一条新途径,酶显色产物具有较高的电子密度,经过适当处理还可以进行免疫电镜观察,免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术,前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上,形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应,称为非标记抗体酶技术。

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