核酸抽提过程中的一些问题解答

一、抽提过程中的现象及可能的原因

I：核酸不溶解或者难溶解 – 蛋白质残留 (虽然目前更多的资料强调的是过分干燥所致。75%乙醇洗涤后，如果是空气干燥，几乎不可能过分干燥的，尤其是在南方潮湿的地方。佐证实验：撕取少量 Merck 的丝状CT DNA到一个离心管中，加入无水乙醇；10分钟后彻底去除乙醇；待乙醇完全挥发后，加入TE，10分钟后溶液就非常均匀而粘稠了。

II：使用异丙醇沉淀核酸，沉淀为白色–多糖残留。

III：核酸溶解后为乳白色–多糖残留。

IV：75%乙醇洗涤异丙醇沉淀的核酸时，沉淀变大了–见10-III。

二、紫外检测

I：A260/A280 比值低 – 蛋白质残留。但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留。

II：A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差 – 苯酚残留。

三、电泳中的现象及可能的原因

I：加样孔有荧光 – 首先一定有 DNA 的滞留；其次多含蛋白质残留；如果是比较特殊的样品，其杂质也可能导致荧光。蛋白质几乎不会被 EB 染色，能出现荧光，则一定含有核酸。非常巨大的基因组DNA (> 50kb)，如果使用普通的琼脂糖电泳，往往不能电泳出孔，单独就可能滞留在加样孔中产生荧光。更多的时候，是比较大的 DNA 与残留的蛋白质结合后，电泳不能出孔而在孔中产生荧光。酶反应产物，如果没有经过纯化去除酶，也非常容易在孔中出现荧光，其原因是酶与核酸几乎都有比较强的结合能力 (基因组 DNA 的PCR 产物电泳往往在孔中都有荧光，而且荧光强度与体系的特异性成反比。)。如果是植物样品，还可能由其它杂质残留引起。我的经验是：蛋白残留的荧光有点发闷，其它杂质残留亮得很刺眼，且薄得锐利。

II：总 RNA 非变性电泳显示过多的条带 – 根本就不是问题。

III：总 RNA 非变性电泳显示 28S 不如 18S 亮，但条带清晰无弥散 – 多提示 28S 没有被 EB 饱和。RNA 残留多时，基因组 DNA 的电泳也会有相似现象。简单的补染可以解决此问题。再次电泳时，或者降低上样量，或者增加胶中 EB 的量。

四、降解的现象、原因及对策

降解的现象，如果抛开问题电泳所致，可以简单总结如下：主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减。如果同时还伴随下列的一个或者多个现象，则需要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。

以现在的裂解液的裂解能力而言，降解的发生主要是在彻底匀浆之前，只有极少量由不干净的溶解液导致。以总 RNA 抽提为例，本站就有帖总结为：总RNA的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织 (此处的质量不仅指纯度，也指完整性才对)。彻底裂解悬浮细胞的时间最短，彻底裂解组织的时间最长，这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品，非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量；但是，有许多实验室并不具备严格的保存手段，实验人员的操作也并非完美，其结果就是核酸的降解。RNA 抽提受的影响因素太多，就以基因组 DNA 的抽提为例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K 的溶液，无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品，如果混匀彻底，可以预期的降解为：细胞 – 不应该降解，碾碎的组织 – 不应该降解，大块组织 (包括鼠尾) – 部分降解。如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象，该现象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象，该现象不是假象，就是样品在保存中已经降解了。说得更极端一点，即使蛋白酶 K 失活了，消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组 DNA 在抽提过程中间不被降解。

减少或者杜绝核酸降解，一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前。样品的保存在前面已经说过了，不重复。其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间。

五、后续酶反应失败

资料书中连篇累牍的原因我就不说了，因为都对。我相信因为大家首先相信的就是它们，所以碰到问题首先一定会从那些方面着手。如果三次实验后，问题还没有解决，那么 90% 的可能在于洗涤方式的不严格导致的小分子物的残留。小分子物像刀，可以陆续“杀”死很多酶；大分子物如蛋白质，像绳子，只能“捆住”一个目的核酸或者酶。更严格的洗涤可以解决该问题。

六、蛋白质是如何残留的

PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。

高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。

介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。

G 小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的

醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。

介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。