蛋白质组学的研究方法与流程

过去蛋白质组学分析之主要内容，就是分别将不同生物的器官、组织、细胞…等的蛋白质利用二维电泳技术（Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）将蛋白质一一分开，然后分析其蛋白质种类、结构资讯，经由电脑软体分析比对，将资料传送到着名的SWISS-PROT及PIR-International（Protein Information Resource）…等资料库中心进行比对。随着基因体资料大增、电脑分析处理能力的进步及生物资讯学的发展，蛋白质组学研究才得以成为二十一世纪生命科学研究的新显学。

1. 蛋白质检体制备（Sample preparation）

譬如器官、组织、细胞、血清或微生物……等，只要有蛋白质的成分存在，皆可用来分析；由于蛋白质可执行许多生物功能，因此具有多样且複杂的物理化学特性；也由于检体形式及检体来源差异极大，因此在进行分析前的检体处理上便极为重要。

首先我们将器官或组织打碎，将细胞打破，加入适当的试剂（例如8 M urea、4 % CHAPS及DTE……等等），取得欲分析的蛋白质检体。

2. 二维电泳分析（Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）

二维电泳分析（2-DE）可以说是蛋白质组分析的主要技术（core technology），整个二维电泳分析过程.

首先将欲分析的蛋白检体以等电点聚焦电泳（Isoelectic focusing , IEF）将蛋白质依等电点（pI）进行第一维分离，续将此分离结果使用SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis）依蛋白质分子量进行第二维分离；由于经过两种原理分离蛋白质分子，因此能够分析非常微量的蛋白质。

其实二维电泳分析（2-DE）并非新兴技术，早在七十年代中期就已经发展出这套电泳分析系统；然而碍于电泳结果再线性不佳，且无法进一步深入分析，因此迟迟未能普及。直到固定式pH梯度胶片（Immobilized pH-gradient strip，IPG）及High Voltage programmed IEF machine的出现，提昇解析度及技术上的实用性，才得以大量应用在研究上(7)。

2.1 第一维：等电点聚焦电泳（Isoelectic focusing, IEF）

蛋白质依本身胺基酸的组成不同，而带有不同电荷数，亦即有不同的等电点，当外在pH值等于蛋白质本身的pI值时，就达到等电点，此时淨电荷为零，蛋白质即固定不动。等电点聚焦电泳（IEF）就是使用一种带有不同酸硷值（pH梯度）的胶条，依照等电点的不同将蛋白质分离。

以往IEF电泳之困难点在于必须自行铸胶，而目前已有商卖改良之「固定式pH梯度胶片（IPG）」，配合厂商开发之电脑化高电压（8,000至10,000 volts, Max）之IEF电泳系统，第一维电泳部分才得以突破。

2.2第二维：SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis）

将作用完毕之IEF置入SDS-PAGE胶片上方，利用SDS-PAGE胶片基质（Matrix）中的分子筛（Molecular sieve），将IEF胶条上已初步分离之蛋白质再依分子量（M.W）大小不同而分开(7)。

3. 电泳胶片染色及影像扫描（Computer scanning）

执行电泳后的SDS-PAGE胶片以适当的染料（如Silver stain、Coomassie brilliant blue或Ruby stain）染色，放入高解析度的扫描器中获得影像。SDS-PAGE胶片也可以转印（Blotting）至Nitrocellulose或PVDF膜上，以免疫化学方法侦测出特定的蛋白质。

4. 影像分析（Image analysis）

经由高效能影像扫描，再以电脑软体分析，可以侦测出蛋白点；也可以与正常或已知的蛋白质模组对照，分析彼此的差异点，选出有意义的标的蛋白质（Target protein）进行探讨。

5. 蛋白质点切割（Spots excision）

藉由仪器以机械手臂将欲探讨或有意义的标的蛋白质点切割下来，将此蛋白质点进行蛋白质鑑定及胺基酸序列分析。

6. 蛋白质鑑定（Protein identification）

6-1 质谱仪分析（Mass spectrometry）

蛋白质鑑定以Edman degradation（一种由蛋白质N端至C端方向切割，逐一解出蛋白质胺基酸序列的方法。）为基础，来定出蛋白质的胺基酸组成份。一般可以定出10至40个胺基酸序列。近年来发展出高效能的质谱仪技术（MALDI-ToF-MS及Q-ToF-MS-MS）能够精准解析出蛋白质的分子量、序列，推断出胺基酸片段上的修饰，例如磷酸化、醣化…等等。

6-2   资料库比对（Database Comparison-bioinformatics）

经由质谱仪分析的蛋白质与蛋白质资料库进行比对，得知此标的蛋白质的种类，或有可能是新的未知蛋白，再由此蛋白质进行学理上的探讨或应用。