小分子蛋白Western blot 检测

实验原理

将经电泳分离的抗原转印到膜上作为固相,利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体

主要试剂

 

试剂配制

4.1.1  40% Bis-acrylamide with 2.6% C （Acrylamide:Bis, 38.95:1.05）

      丙烯酰胺         77.9g

      双甲叉丙烯酰胺   2.1g

      Total             200ml

4.1.2  30%胶溶液:

0.8    双甲叉丙烯酰胺    0.8g

29.2% 丙烯酰胺          29.2g

        total             100ml

4.1.3  3M TrisHCl , pH 8.45

      36.3g    Trisbase  

      Total    100ml

4.1.4   WG ( water   Glycerol):   

       Water:     58ml

       Glycerol:   36ml

       Total:      94ml

4.1.5    10x Electrophoresis Buffer stock pH8.3 （to make the working buffer, just dilute 10 times. Do not adjust pH , pH should be 8.3.）

Trisbase       60.5g

Tricine        89.5g

SDS          5g

          total          500ml

4.1.6   10% SDS

        SDS    10g

        Total    100ml

4.1.7    2x Laemmli Stacking Buffer pH6.8:

0.25M Tris       15.14g

0.2% SDS        1g or 5ml 20% SDS

          total         500ml

4.1.8  5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:

Stock:                                    to use:

20% Glycerol      100ml                  take 9.5ml stock        

10% SDS         50g or 250ml 20% SDS    add BME 0.5ml

250mM Tris       15.14g                  bromphenol blue or 

          total           475.00ml                pyronine 4 to taste

4.1.9  transfer buffer                      

48mM Tris base      5.81g

39mM Glycine       2.93g

0.037% SDS         0.375g or 1.875ml of 20% SDS

40% MeOH          400ml

total           1000ml

 

4.1.10  TBST

10mM Tris-HCl, pH7.4

100mM NaCl

0.2% Tween-20

         Total  1000ml

4.1.11 稀释液  TBST  5% 脱脂奶粉

4.1.12  ECL底物溶液  A液1ml   B液1ml，临用时配制

4.1.13  DAB底物溶液

DAB(3,3二氨基联苯胺)         50mg

0.05mol/L Tris-Base（PH7.6）    100ml

先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，使用稀释，临用时加入30%H2O2，在工作液中终浓度0.01％

4.1.14  PSQ膜

4.1.15  甲醇

4.1.16  显影液

4.1.17  定影液

4.1.18  X光胶片

 

主要设备

电泳仪

实验材料

 

分离胶、间隙胶及浓缩胶配方比例

 

分离胶配方： 15% 

Separating Gel (15%)	1块胶
WG	1.88ml
40％ Gel.sol	2 ml
3M TrisHCl  pH 8.45	2 ml
10% SDS	0.06 ml
10%APS	0.06 ml
TEMED	0.003 ml
Total	6.003 ml

 

间隙胶配方： 10% 

Spacer Gel (10%)	1块胶
dH2O	0.47 ml
30％ Gel.sol	0.5 ml
3M TrisHCl  pH 8.45	0.5 ml
10% SDS	0.015 ml
10%APS	0.015 ml
TEMED	0.0015 ml
Total	1.5015 ml

 

浓缩胶配方：4% 

Stacking Gel (4%)	1块胶
2×Stacking. buffer	1.5ml
30％ Gel.sol	0.75ml
ddH2O	0.75ml
TEMED	4ul
10%APS	40ul
Total	3.44ml

 

感谢您对labfere的关注，祝您实验顺利

 

实验步骤

 

操作步骤

4.2.1   Tricine-SDS-PAGE（分离胶、间隙胶、浓缩胶配方参见附录）

4.2.1.1  做分离胶，加水封胶，待其凝固。

4.2.1.2  做间隙胶，加水封胶，待其凝固。
4.2.1.3  做浓缩胶，插梳子。

4.2.1.4  待浓缩胶凝固后，拔掉梳子，并将架子转移到电泳槽中，先在中部加入1x Electrophoresis Buffer  pH8.3，点样。
4.2.1.5  调节电压到60v,开始电泳，一小时后电压升至120v。 
4.2.1.6  溴酚蓝开始跑出最下端时停止电泳

4.2.2电转印
4.2.2.1  将PSQ膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再用transfer buffer浸泡，同时将滤纸浸泡入transfer buffer 中. 

4.2.2.2  转移。在电转移仪上铺好滤纸，膜和胶，如图。滤纸一般用三层，滤纸和膜、膜 和胶之间一定不能有气泡。装好电转移仪, 根据需要选定所需的电流。转移时间一般为2.5 小时,( 1mA-2mA/cm2, 10% gel), 可根据分子量大小调整转移时间和电流大小.转移过程中随时观察电压的变化,如有异常应及时调整

4.2.3  免疫印迹

4.2.3.1  转移结束后，将膜放入稀释液中封闭，4℃孵育16小时 或 室温孵育1小时

4.2.3.2  按需求稀释一抗，加在膜上相应的位置，室温 孵育1小时

4.2.3.3  用 TBST洗三次,每次5min

4.2.3.4 加酶标二抗，室温孵育1 小时. 一般采用HRP标记的二抗, 稀释比例为1:5000（参考：一张膜，10ml  牛奶 2ul二抗，两张膜，20 ml 牛奶4ul二抗）

4.2.3.5 用TBST洗三次,每次5min

4.2.3.6 显影。在暗室里，将PSQ膜泡在ECL底物溶液1分钟左右(一般每张膜,用1.6ml-2.0ml的反应底物)，然后用保鲜膜将PSQ膜包好，放入暗盒；关掉日光灯，打开红外灯，取出胶片，折左上角作记号，铺到膜上，夹好暗盒；1分钟后取出胶片，放入显影液中，轻轻振荡，3分钟后取出，清水洗涤一次，放入定影液中，轻轻振荡，3分钟后观察结果，并根据第一张的曝光情况，调整下面胶片的曝光时间和曝光区域

4.2.3.7显影完后收拾好暗室的物品，带胶片离开

 

4.2.3.8  也可用DAB底物溶液显色