sgRNA的设计与载体构建

2020-02-17 戚诗诗上海交通大学医学院附属仁济医院

浏览

实验概要

1. CRISPR的介绍：
CRISPR的全称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(规律成簇的间隔短回文重复序列)。实际上就是一种基因编辑器，由于细菌自身具有降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制，从而科学家发现了CRISPR系统。也就是说，一些具有逆转录功能的病毒（如：慢病毒）能把自己的基因整合到细菌上，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，从而进化出CRISPR系统。

2. CRISPR的元件：
CRISPR系统包含两个组件，一个是sgRNA，另一个就是Cas 9蛋白。sgRNA是一个短的合成RNA，只有20bp大小，可以与Cas9蛋白结合，所以在设计sgRNA之前，应在基因组上寻找PAM序列（PAM：Protospacer Adjacent Motif），PAM序列是有固定形式的，来自于不同菌种属的Cas，它的PAM序列形式是不一样的。我们现在用的是SpCas 9，Cas 9蛋白来源于S. pyogenes （化脓链球菌）II型CRISPR系统。所以，我们的PAM序列应该为-NGG的形式，“N”可以是A,T,C,G中的任何一个。Cas 9其实就相当于是限制性核酸内切酶，使PAM序列前形成DSB（Double Strand Break）。所以，sgRNA其实相当于是向导，告诉Cas 9蛋白在哪进行切割。

所以，我们要做的就是将设计好的sgRNA进行合成，并将其连接到含有Cas 9的载体上。并转化到Stellar、Stable或Stable3感受态中，进行表达。

实验原理

规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA 。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA ，阻止病毒完成其功能。该切割DNA的机制与2012年被证实广泛适用于真核生物，从而引发了后续的以CRISPR/Cas9为基础的第三代基因编辑工具的研究热潮。在真核细胞中双链的DNA断裂（Double strand break, DSB）可以引发两种修复机制，其中非同源末端结合（Non-homologous end joining, NHEJ）可以产生数个碱基的随机删除或插入，从而引发移码突变，这便是基因编辑工具进行基因敲除的原理；此外在有同源序列存在时可以进行同源重组修复，该机制可以实现外源基因的敲入或者定点修饰。
相比前两代基因编辑工具ZFN系统和TALEN系统，CRISPR/Cas 9技术的优点比较显著。首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点，这大大限制了使用范围。其次，Cas9扩展性强，正如本公司使用的Cas9n，是一种只进行单链切割的Cas9突变型，该酶可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要替换一段核酸序列，几乎任何实验室都可以开展工作。

主要试剂

一、所需试剂：
1. PCR聚合酶：

实验步骤

1. sgRNA的设计：
（1）sgRNA的设计原则：
1）sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统（SpCas 9）一般为20nt。

2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列为位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)，所以选择3'末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为30%-70%（40%-60%）。

3）sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。

4）如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。

5）全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个。
6）如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上。
（2）sgRNA的设计步骤

通过网址：https://www.deskgen.com/landing/cloud进行sgRNA的设计，进入网址后点击KNOCK OUT进入设计页面，输入想要设计sgRNA的名称后，进行sgRNA的选择。由于内含子在基因表达的过程中，不会进行表达且会被删掉，所以我们在设计sgRNA时一般在靠近启动子的第一个CDS区（也就是外显子的保守结构域）进行sgRNA的选择。在网站上，On-Target和Off-target都是有评分的，一般来说，评分越高，则sgRNA越好。On-Target其实就是sgRNA对目标位点识别后与DNA模板进行识别切割的的效率，所以准确性越高，On-Target的评分越高。Off-Target也就是脱靶效应，由于CRISPR技术的切割是由sgRNA根据PAM序列定位识别位点，从而进行切割，但是如果sgRNA识别的位点是错误的，就产生了错误切割，这样就产生了脱靶效应。所以说，在进行sgRNA选择的时候，要尽可能地选择脱靶效率比较低的，也就是Off-target分值比较高的。另外，符合sgRNA的其它设计原则就可以了。

2. PCR扩增

1. 反应体系：

Mix	12.5 μL
R	0.75 μL （10pmol/ μL） 5-7.5 pmol
F	0.75 μL （10pmol/ μL） 5-7.5 pmol
模板	<100 ng
ddH2O	Up to 25 μL
Total	25 μL

2. 反应程序：

1）模板少于100 ng：30-35 cycles

变性	退火	延伸
98℃	℃	72℃
10 sec	5-15 sec	5 sec/kb

2）模板大于100 ng：30-35 cycles

变性	退火	延伸
98℃	℃	72℃
10 sec	5-15 sec	30-60 sec/kb

【退火温度】退火温度是根据设计的引物决定的，不同的引物对，退火温度不同。

【延伸时间】不同的模板大小，延伸的时间是不一样的，一般1 kb/min。

3. 电泳验证：

1）琼脂糖凝胶制备：

琼脂糖用量	1× TAE Buffer
0.2 g	25 mL
0.4 g	45 mL
0.8 g	85 mL
加入 SYBR Safe DNA stain 3-5 μL

2）电泳缓冲液配方：（1 L）

50× TAE Buffer	ddH2O
200 mL	980 mL

将50× TAE Buffer稀释成1× TAE Buffer。

3）点样量：5 μL样品 5 μL 10× Loading Buffer

4）120 V，电泳30 min。

PCR产物纯化

（1）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将目的条带进行胶回收。

（2）胶回收过程：

①　先准备1个新的1.5 mL的离心管，并称量管子重量。例如：1号离心管重量为A g。

②　将目的条带的紫外灯下进行切胶回收。将切下的胶放到1号离心管中，并称重。例如：1号离心管加切目的条带的胶总重为B g。

③　计算切割的目的条带的胶的重量。（B-A）g

④　每100 mg的胶加200 μL的NT1，加入NT1后，旋涡振荡1 min，50℃孵育5-10 min。每隔2-3min拿出来，旋涡振荡30 sec，直到胶全部溶解，作为样品。

⑤　纯化柱放在洗脱柱上后，加700 μL的样品到洗脱柱上，11000 g，离心30s。（如果需要的话，此步骤可重复一次）

⑥　将洗脱柱中的流液倒掉，加入700 μL的NT3，11000 g，离心30 sec。

⑦　重复步骤6一次。

⑧　将洗脱柱中的流液倒掉后，将纯化柱再放在洗脱柱上，11000 g，空离1 min。

⑨　加入15-30 μL的Buffer NE或ddH2O。（如果DNA片段>1000 bp，Buffer NE或ddH2O需要加热到70℃后，再进行洗脱。）

连接反应

1. T4 DNA ligase连接反应体系：

T4 DNA ligase	1 μL
Insert Gene	μL （<1 mg）
Plasmid	μL （<1 mg）
T4 DNA ligase buffer	2.5 μL
ddH2O	μL
Total	To 20 μL

混匀后，室温培养10 min。用于转化。

2. In-fusion 连接反应体系：

5× In-fusion HD Enzyme Premix	2 μL
Insert Gene	μL （10-200 ng）
Plasmid	μL （50-200 ng）
ddH2O	μL
Total	To 10 μL

混匀后，50℃培养15 min。

【注意】

1）Insert Gene加入的量由其片段的大小决定：<0.5 kb, 10-50 ng；0.5-10 kb, 50-100 ng; >10 kb, 50-200 ng;

2）Plasmid加入的量由其片段大小决定：<10 kb, 50-100 ng; >10 kb, 50-200 ng。

3）For reactions with larger combined volumes of vector and PCR insert (>7 μL of vector insert), double the amount of enzyme premix, and add ddH20 for a total volume of 20 μL. 如果结合的体系比较大的话，也就是说insert vector大于7 μL，可以扩大反应体系，加ddH20到20 μL。

4）In-fusion反应的时间不能超过15 min，增加反应时间不仅不能提高克隆效率，反而可能引起多元插入的克隆反应。

5）In-fusion之前，应将insert和vector都进行DPn I消化，每管加2 μL DPn I，37℃，1h。去除PCR反应当中剩余的模板。

转化

1. 将Stellar、Stable或Stable 3感受态放在冰上融化。

2. 2.5 μL In-fusion反应产物加到50 μL Stellar、Stable或Stable 3感受态中，冰置30min。

3. 42℃，热激45 sec。

4. 冰置1-2 min。

5. 加入500 μL SOC培养基，37℃，160-225 rpm，培养1-1.5 h。（SOC培养基使用前要提前放到37℃摇床中复温）

6. 6 000 rpm，离心5 min，去上清后，加入100 μL新鲜的SOC培养基，将沉淀吹散。

7. 将其按梯度涂在含有Amp抗生素的LB固体培养基上。37℃培养12-14 h。

8. 第二天，挑取单菌落，在含有Amp抗生素的LB液体培养基里培养12-14 h。

9. 提质粒，双酶切验证。

LB 固体培养基配方：（1L）

样品名称	用量
NaCl	10 g
酵母提取物	5 g
蛋白胨	10 g
琼脂	15g
ddH2O	1 L

LB 液体培养基配方：（1L）

样品名称	用量
NaCl	10 g
酵母提取物	5 g
蛋白胨	10 g
ddH2O	1 L

293T细胞培养
1. 将293T细胞的细胞上清倒掉后，用DPBS将细胞进行洗涤，除去死细胞及血清。
2.用胰蛋白酶对细胞进行消化，室温静置1min，用移液管将胰蛋白酶吸出。
3.消化后，用手敲培养皿，让细胞沉到培养皿底部后，用细胞培养基再将细胞悬起，按1:6的比例稀释。

培养瓶、培养皿的面积及规格：

（1）细胞培养皿:

产品编号	产品描述	建议上液量
430165	规格：35mm；高度：10mm；生长面积：8cm2	3ml
430166	规格：60mm；高度：15mm；生长面积：21cm2	5ml
430196	规格：60mm；高度：15mm；生长面积：21cm2	5ml
430167	规格：100mm；高度：20mm；生长面积：55cm2	10ml
430293	规格：100mm；高度：20mm；生长面积：55cm2	10ml
430599	规格：150mm；高度：25mm；生长面积：148cm2	30ml
431110	规格：245mm(方形)；高度：25mm；生长面积：500cm2	100ml
431112	规格：245mm(方形)；高度：25mm；生长面积：500cm2	100ml

（2）细胞培养瓶:

产品编号	产品描述	建议上液量
430639	规格：25cm2，矩形，斜颈，透气盖	5ml
430641	规格：75mm2，矩形，斜颈，透气盖	15ml
430825	规格：150cm2，矩形，斜颈，透气盖	30ml
431080	规格：175cm2，矩形,角度颈,透气盖	35ml
3001	规格：225cm2，矩形，斜颈，透气盖	45ml

（3）细胞培养板：http://www.bio-equip.com/show1equip.asp?equipid=300277

产品编号	产品描述（单孔面积，体积）（128 x 86）	建议上液量
	规格：6孔板，9.5 cm2，16.5mL	2.5-3.0ml
	规格：12孔板，3.9cm2，6.5mL	2.0ml
	规格：24孔板，1.75cm2，2.9ml	1.0ml
	规格：48孔板，1.0cm2，1.7ml	0.5ml
	规格： 96孔板，0.32cm2，0.37mL（平底） 96孔板，0.35cm2，0.30mL（U-底） 96孔板， 0.28cm2，0.23ml（V-底）	0.1-0.25ml
	规格：384孔板，0.1 cm2， 0.12ml	0.06ml
	规格：1536孔板，0.02 cm2，0.012ml	0.015ml
	规格：4孔板，16.0cm2（132 x 82）	5.0ml
	规格：8孔板，8.6cm2（132 x 82）	3.0ml
	规格：4孔板，21.8cm2（128 x 86）	5.0ml

（）

细胞培养板的选择

http://www.bio-equip.com/showarticle.asp?id=453060483

培养器皿	底面积（cm2）	加培养液量（mL）	可获细胞量
96孔培养板	0.32	0.1	105
24孔培养板	2	1.0	5×105
12孔培养板	4.5	2.0	106
6孔培养板	9.6	2.5	2.5×106
4孔培养板	28	5.0	7×106
3.5cm培养皿	8	3.0	2.0×106
6cm培养皿	21	5.0	5.2×106
9cm培养皿	49	10.0	12.2×106
10cm培养皿	55	10.0	13.7×106
25cm塑料培养瓶	25	5.0	5×106
75cm塑料培养瓶	75	15~30	2×107
25cm玻璃培养瓶	19	4.0	3×106
100cm玻璃培养瓶	37.5	10.0	6×106
250cm玻璃培养瓶	78	15.0	2×107
2500cm旋转培养瓶	700	100~250	2.5×108

24孔板：PLL 100-200μl（200μl）即可，铺板2h后，吸出PLL（回收），PBS冲洗2次，晾干备用或不晾干直接用。加培养液量1ml ，注意调整细胞密度。

25cm2（5ml）→（1:2）50cm2（10ml）——（1:3）75cm2（15ml）

2cm2（1ml）→1/25——1/40总细胞悬液

96孔板：PLL 20-40μl（40μl）即可，铺板2h后，吸出PLL（回收），PBS冲洗2次，晾干备用或不晾干直接用。加培养液量0.1ml-0.2ml ，注意调整细胞密度。

25cm2（5ml）→（1:2）50cm2（10ml）——（1:3）75cm2（15ml）

0.32cm2（0.1-0.2ml）→1/150——1/250总细胞悬液

细胞的转染
1. 提前一天将293T细胞进行传代后，培养12h。
2. 提取构建好的sgRNA的重组质粒，准备进行包病毒。
3. 先加入Opti 500uL 到2个1mL的离心管中，分别标记1号和2号。
4. 再将Lenti-构建好的sgRNA的质粒取出5ug加到1mL离心管中。
5. 将3ug 8.91和1ug MD2-G加到1mL离心管2号中，混匀。
6. 将2号管的混合物加入到离心管3中，混匀。
7. 向离心管中加入27uL Mirus混匀，再加入到离心管3中，混匀。
8. 将3号管的液体均匀滴加到培养293T细胞的10cm Dish中，混匀，培养箱培养60h。

收病毒
1.将转染后的细胞吸15mL离心管中，500g，离心10min。
2.用10mL注射器和滤膜将离心后的上清进行过滤。
3.过滤后，加1X的沉淀剂，4℃，12h。
4.沉淀后将其进行离心，1500g，离心30min。
5.倒掉上清，还剩一部分上清，继续离心，1500g，离心5min。
6.用1mL枪头将上清洗出后，加入原液总体积的1/10到1/100的PBS或DMEM。
7.将病毒分装后，-80℃冻存。

基因编辑的验证
一、提取293T细胞的基因组DNA，Universal Genomic DNA kit (康为世纪,CW2298M)
1. 贴壁细胞应先处理为细胞悬液（最大提取量为5x106个细胞），2000rpm，离心5分钟。
2.弃上清，加200uLGTL，振荡至样品彻底悬浮。
3.加入200uL Proteinase K，瞬时离心，去除管壁盖内壁的水珠。
4.加入200uL无水乙醇，旋涡震荡，充分混匀，瞬时离心。
5.将上步溶液全部加到吸附柱上，12000rpm，离心1min。倒掉废液。
6.向吸附柱中加入500uL Buffer GW1，12000rpm，1min，倒掉废液。
7.向吸附柱中加入500uL Buffer GW2，12000rpm，1min，倒掉废液。
8.12000rpm，离心2min。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晒干。
9.加50uLddH2O，12000rpm，离心1min，-20℃保存。